| Research Abstract |
1.(1)実用化に最も重要なハイブリドーマG2およびG6株をHy606培地で培養し,2〜4日毎に継代し,それぞれ3,4代目の培養上清について安全試験を行った。卵接種試験の結果,胎児を死亡させたり,血球凝集を起こしたり,漿尿膜に異常を起こす因子は見出されなかった結果を得た。(2)動物試験(乳のみマウス,成熟マウス,モルモット)の結果,生死,臨床症状を観察,そのいずれにも異常を認めなかった。(3)in vitroで,上記培養細胞の超音波上清について調べた結果,VeroまたはMDCK細胞に変性を起こしたり,血球の凝集または吸着を起こす因子,各細胞に感染するRT活性をもつ因子は見出されなかった。(4)Co-cultivation(MRC-5細胞,Vero細胞)の結果,細胞変性を起こしたり,血球の凝集または吸着を起こす因子およびRT活性をもつ因子は見出されなかった。2.G2,G6株を大量連続細胞培養し,血清無添加培地での産生至適条件を決めた。3.ヒトモノクローナル抗体(MAb)G2,G6を高速液体クロマトグラフィー(Protein A-セルロファインカラム,FPLC-Mono S)を組み合わせ高度に精製する一方,毒素の各フラグメントをパパイン,V8プロテアーゼ,リジルエンドペプチダーゼ処理した消化物を逆相クロマトにかけ,各フラクションをドットブロッターでニトロセルローズ膜に吸着させ,各MAbを用いて免疫染色し,エピトープの毒素分子上での詳細な局在を決定しつつある。4.MAbの超可変領域のアミノ酸配列を決定するため,ハイブリドーマ株G2,G6より総RNAを抽出しcDNA第一鎖合成の鋳型とした。次にこれを鋳型としてPCR法を行い,超可変領域の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子断片をプラスミドに挿入し,得られた各クローンの塩基配列を決定しつつある。5.大量連続培養により産生したMAb-G2,G6について,中和活性の最高の相乗効果を示す条件を求め,in vivoでの受動免疫による予防効果をマウスを用いて調べた。
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