癌化、進展に関与する発現遺伝子の新たな検出法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557235
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 澤田 淳 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (10079874)
• Keywords: 発現遺伝子の検出法 / FISH法 / 蛍光プローブ / 画像処理

Research Abstract

癌の発生、進展に関与する発現遺伝子を検出する新たな方法を開発する目的で、遺伝子上で実際に発現している遺伝子領域をvisualに検出する手段として、Comparative mRNA Hybridization(CmRH)を考案し実用化に向けての検討を行った。
本手法は、(1)目的組織と対照組織より抽出したtotal RNAから、digoxigenin、あるいはbiotin標識したそれぞれのcDNA probeを作製する。(2)これを正常リンパ球のmetaphase上に同時にhybridizationさせた後、FITC(緑)、Rhodamine(赤)で二次標識する。(3)蛍光顕微鏡とCCDカメラにてに検出し、画像処理にて緑と赤の蛍光量を比較・定量化する。以上の3つのstepからなる。
研究期間中に以下の知見を得た。
1.total RNAからのcDNA probeの作製:oligo(dT)primer,biotin-dUTP,digoxgenin-dUTP存在下に逆転写酵素を用い標識cDNA probeを作製する方法では、probe sizeが2-3kbとなりcomparative hybridizationには長すぎたが、いったんcDNA作成後、Nick translationで標識することで至適size(500-1000bp)のprobe作製が可能であった。
2.hybridizationの問題:cDNA probeの場合DNA probeに比べhybridization効率が悪く、洗浄化過程の]stringencyを下げ試みたが,非特異的なhybridizationの増加のため解析困難であった。この原因はDNAとcDNAとのhybridizationにおけるイントロン領域でのミスマッチと考えられ、この問題の解決がCmRHの実用化に不可避と考えられた。

Research Products

• [Publications] Koshizawa S, Sawada T.et al.: "Alteration of midkine expression associated with chemically-induced differentiation in human neuroblastoma cells." Cancer Letters. 111. 117-125 (1997)
• [Publications] Ishida H, Sawada T.et al.: "MAGE-1 and MAGE-3/6 expression in neuroblastoma-related pediatric solid tumors." Intl J Cancer. 69. 375-380 (1996)
• [Publications] Takahiro Gotoh, Tadashi Sawada.et al.: "Human Neuroblastoma Demonstrating Clonal Evolution In Vivo." Genes Chromosomes & Cancer. 22(in press)(未定). (1998)
• [Publications] 石田宏之: "小児固形腫瘍におけるMAGE-1およびMAGE-3遺伝子の発現とその意義" 日本小児科学会雑誌. 100(4). 723-731 (1996)
• [Publications] 四方あかね、 澤田 淳: "神経芽腫におけるN-myc増幅とtrk発現" 小児科臨床. 50. 722-728 (1997)
• [Publications] Takeo Tanaka, Tadashi Sawada.et al.: "Trk A gene expression in neuroblastoma." Cancer. 76. 1086-1095 (1995)