1995 Fiscal Year Annual Research Report
固相化プローブを用いる自動DNA診断システムの開発
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07557243
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Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
近藤 洋一 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (70008598)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 修三 (株)ユニオン, 技術開発課・技術開発, 室長(研究員)
近藤 壽彦 群馬大学, 生体調節研究所, 助手 (10162108)
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| Keywords | 遺伝子診断 / 自動分析 / HPLC / 固相法 / 蛍光標識 / PCR法 |
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| Research Abstract |
1.基本ハードウエアを組み立て自動化技術を確立した。
(1)HPLCシステム(本研究用に購入した設備)((a)試料注入用のオートサンプラー(電子冷熱式恒温ラック付)、(b)溶離液・反応液輸送用のイナ-ト型ポンプ、(c)送液用グラジェンター、(d)フロー式蛍光モニター、(e)各ユニットを一括コントロールし、かつデータ解析するためのコンピュータ、そして(f)分析結果を表示するためのプリンターを含む)に、サーマルコントローラー(本研究用に購入した設備)を組み込んだ基本システムを構築した。(2)サーマルコントローラーを改造した。カラム内で、PCR増幅反応を行うために、少なくとも3本のカラムをその内部に装着できるヒートブロックを試作し、そのうちの1本をダミ-カラムとし、温度を計測モニターできるように工夫した。(3)カラム圧、カラム温度、流速、流量などの各種試験を行ない、最適化をはかった。(4)被検試料の注入からデータ処理にまで至る、全行程の分析ステップを実施するために必要な、オートサンプラー動作、ポンプ動作、サーマルコントローラー動作などを一括制御するためのコンピュータプログラムを作成した。
2.種々の固相化プローブを容易に装脱着する技術を確立した。
(1)固相担体にDNA又はRNAを結合することのできる核酸固相化アンカーを調製した。(2)カラム内でのリガーゼ反応、制限酵素反応、DNA合成反応等の最適化条件を検討した。(3)12b〜数kb程度の任意の配列をもった核酸プローブを核酸固相化アンカーに容易に連結できる技術を開発した。(4)制限酵素切断によって、アンカーからプローブを切り出す技術を確立した。
3.蛍光標識プライマーを用いる高感度測定システムを開発した。
(1)適当な制限酵素で切断された被検DNA断片の両末端に、蛍光標識リンカーを連結するための末端標識技術を確立した。(2)微小量の標的DNAを蛍光標識プライマーによって特異的にPCR増幅し、蛍光モニターによって検出する技術を確立した。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] T. Kimura: "Thyrotoropin-induced hydrogen peroxide production in FRTL-5thyroid cells is mediated not by adenosine 3',5'-monophosphate, but by Ca^<2+> signaling followed by phospholipase A2 activation and potentiated by an adenosine derivative." Endocrinology. 136. 116-123 (1995)
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[Publications] K. Sho: "Cooperation of TSH but not basic fibroblast growth factor with an adenosine receptor agonist in Ca^<2+> mobilization from thapsigargin sensitive pools in single FRTL-5 thyroid cells." Endocrinology. 136. 770-778 (1995)
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[Publications] F. Okajima: "Intercellular cross-talk between thyrotropin receptor and A_1-adenosine receptor in refulation of phospholipase C and adenylate cyclase in COS-7 cells transfected with their receptor genes." Biochem. J.306. 709-715 (1995)
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[Publications] F. Okajima: "Pertissis toxin inhibits phospholipase C activation and Ca^<2+> mobilization by sphingosyl-phosphorycholine and galactosylsphingosine in HL60 leukemia cells." J. Biol. Chem.270. 26332-26340 (1995)
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[Publications] F. Okajima: "Involvement of pertussis toxin-sensitive GTP-binding protein in sphingosine 1-phosphate-inducd activation of phospholipase C-Ca^<2+>system in HL60 leukemia cells." FEBS Letters. 379. 260-264 (1996)
