1997 Fiscal Year Annual Research Report
PAF代謝酵素に作用する新規抗PAF薬の開発を目的とした遺伝生化学的研究
| Project/Area Number |
07557302
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
瀬高 守夫 帝京大学, 薬学部, 教授 (70012630)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 政満 日清食品東京研究所, 研究員
清水 文月 帝京大学, 薬学部, 教務職員
佐藤 典子 帝京大学, 薬学部, 助手 (80162460)
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 助手 (50246021)
唐沢 健 帝京大学, 薬学部, 講師 (50186029)
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| Keywords | PAFアセチルヒドロラーゼ / PAF / 血小板活性化因子(PAF) / cDNAクローニング / ゲノムDNAクローニング / lysoPAFアセチルトランスフェラーゼ |
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| Research Abstract |
1.モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼのcDNAクローニングと発現
精製モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼ(分子量63kDa)の部分アミノ酸配列を気相法シークエンサーにより決定し、モルモット肝臓cDNAをテンプレートとして得られた約600bpの特異的PCRフラグメントをプローブとして、モルモット肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした。30万pfu中4個のポジティブクローンを検出し、さらに5'RACE法により完全長のcDNAを得た。次にリコンビナントタンパクを大腸菌で発現させ、本遺伝子産物が活性を持つことを確認した。塩基配列より予想されるタンパクは436アミノ酸(推定分子量49kDa)から成り、セリンエステラーゼに典型的なモチーフを有していた。
2.組換モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼの特異的抗体を用いた解析
リコンビナント酵素をウサギに免疫して特異的抗体を得た。この抗体は血漿中の63kDaの蛋白質と反応すること、アスパラギン結合型糖鎖により修飾可能な配列を3個所有することから、本酵素は翻訳後修飾を受けている可能性が考えられた。本抗体によりマウス肥満細胞が刺激に応じて本酵素を分泌することが明かとなった。
3.モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼのゲノムDNAのクローニング
モルモット脾臓ゲノムDNAライブラリーより本酵素のプロモータ領域を含むクローンを得て、5'上流の約6kbpをシークエンスし、現在レポーターアッセイによる転写調節領域の解析中である。今後、免疫化学的手法を組みあわせることにより、分子レベルでの発現調節機構と病態への関与についても解析していく方針である。
4.アセチルトランスフェラーゼ酵素タンパクの単離精製
種々の界面活性剤を検討したが、可溶化は難しく、現在精製の途上にある。
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[Publications] Karasawa,K.,et al.: "Cloning,Expression and Characterization of Plasma Platelet-Activating Factor-Acetylhydrolase from Guinea Pig" J.Biochem.120. 838-844 (1996)
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[Publications] Sasaki,T.,et al.: "A Distribution Study of ^<11>C Platelet-Activating Factor(PAF)Analogs in Normal and Tumor-Bearing Mice" Nuc.Med.Biol.23. 309-314 (1996)
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[Publications] Nakajima,K.,et al.: "Activated Mast Cells Release Extracellular Type Platelet-activating Factor Acetylhydrolase That Contributes to Autocrine Inactivation of Platelet-activating Factor" J.Biol.Chem.272. 19708-19713 (1997)
