ヒト組織材料を用いて遺伝子異常を検出するために分子診断法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557326
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 塩田 浩平 京都大学, 医学研究科, 教授 (80109529)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚原 正人 山口大学, 医学部, 助教授 (20136188) ; 石橋 誠 京都大学, 医学研究科, 助手 (30232341) ; 森 千里 京都大学, 医学研究科, 助教授 (90174375)
• Keywords: FISH法 / 性染色体特異的遺伝子 / 性別判定 / 性分化異常 / ヒト胎児 / 分子診断

Research Abstract

1)Fluorescent in situ hybridization(FISH)法による固定組織切片上での特異的DNA塩基配列の検出
ヒトのXおよびY染色体に特異的なDNA配列に対するプローブDXZlおよびDYZl(oncor社製)を用い、ヒト胎児固定標本の切片でFISH法を施行した。その結果、パラホルムアルデヒド(PFA)固定後24時間以内に包埋した組織については良好なシグナルが得られ、男性胎児の組織では細胞核ごとにDXZlとDYZlに対するシグナルがそれぞれ1個ずつ、女性胎児の細胞ではDXZlに対するシグナルのみが核に2個ずつ検出された。これにより、固定胎児標本を用い、FISH法で特定遺伝子のシグナルを検出できることが明らかになった。
2)ヒト胎児組織を用いてFISH法を行うための至適条件の検討
DXZlおよびDYZlのプローブを用いてFISH法を行う場合の標本の処理方法を検討した。4%PFAまたは10%ホルマリンで固定した標本ではFISH法によるシグナルが検出されたが、ブアン固定した標本では検出されなかった。またPFAで固定した場合、固定液中に1週間以上置くと反応が弱くなった。Proteinase K処理は45〜60分間が適していたが、組織によって至適処理時間は異なっていた。以上から、ヒト胎児組織を用いてFISH法を行うためには新鮮な組織を4%PFA、4℃で固定した後、24〜48時間で包埋し、4〜6μmの厚さの切片を作成して反応を行うのがよいと判断された。なお、この方法を用いた場合、パラフィン包埋後少なくとも5年間までの標本については良好なFISHのシグナルが得られることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Mori, C. et al.: "Programmed cell death in the interdigital tissue of the fetal mouse is apeptsis with DNA Fracmentation" Anatomical Record. 242. 103-110 (1995)
• [Publications] 塩田 浩平: "器官形成とアポトーシス" 日産婦関東連合地方部会会報. 32. 63-67 (1995)
• [Publications] Uehara, Y. et al.: "Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor" Nature. 373. 702-705 (1995)
• [Publications] Mori, C.: "Significance of programmed cell death(apoptsis) in mammalian limb and palate development" Acta Anat Nippon. (印刷中). (1995)
• [Publications] Oka, C. et al.: "Disruption of the mouse RBP-JK gene results in early embryonic death" Development. 121. 3291-3301 (1995)