心筋細胞内オキシダントストレスと信号応答:細胞内酸素濃度分布の実時間測定法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557343
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 篠山 重威 京都大学, 医学研究科, 教授 (70109007)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木原 康樹 京都大学, 医学研究科, 助手 (40214853) ; 松森 昭 京都大学, 医学研究科, 講師 (70135573)
• Keywords: 心筋細胞 / 酵素分圧 / 虚血 / 再灌流 / 分子生物学 / カルシウム

Research Abstract

心筋組織はその収縮-弛緩活動の維持に絶えずATPの加水分解を必要とし、そのturnoverは極めて高いことが知られている。細胞はATPの供給を専らミトコンドリアによる酸化的リン酸化に依存しているため、この代謝反応には細胞内への酵素の供給が不可欠である。従って、ATP回転の高い心筋細胞においては、この細胞質内酸素濃度分布の持つ意味は大きく、直接その代謝状況や細胞内シグナリングを制御している可能性がある。しかしながら細胞内酸素分圧を直接測定した研究は皆無である。本研究において我々は、phosphorescenceのquenchingの定量化により共焦点レーザースキャン顕微鏡下に、細胞質内酸素濃度分布を測定するシステムの開発を試みる。現在下記の実験設定をすすめている。
共焦点レーザースキャン顕微鏡下における単離心筋細胞内酵素濃度分布測定システムの開発:単離心筋細胞にマイクロパイペットを用い細胞膜にギガオームシールを作製、同部よりパイペットを介して細胞内透析法により、プローブ(Pb-meso-tetra(4-carboxyphenyl)phorphyrin)を細胞内に導入する。同細胞を共焦点レーザースキャン顕微鏡上に設置し、illuminationには、Argoneレーザー光を400±5nmフィルターを通して、細胞全域をスキャンする。ブロープのemissionは>635nmのlongpassフィルターを介して検出する。各スキャンポイントにおける酸素濃度はStern-Volmer関係(to/t=1+qkx to x Ps_2; toはO_2=0における半減期、qkはプローブの反応定数で、実験温度に依存している)に対して限定されたquenchingの半減期を代入することで決定される。半減期はμ secのオーダーであり、各スポットにおいて測定に要する時間はmsec以下と考えられ、細胞全域にわたっても1秒以内でキャナンは終了する。得られた酸素濃度分布は、画像処理システムで疑似カラー化されCTR上に表示される。画像取得が可能となれば、表在灌流溶液中の酸素濃度を窒素ガス添加により低下させた際の細胞内酸素濃度変化と細胞内分布を記録し、基本的な反応性を検討する。

Research Products

• [Publications] Kihara Y, Sasayama S,Inoko M, Morgan JP.: "Sodium/Calcium exchange modulates intracellular calcium overload during posthypoxic reoxygenation in mammalian working myocardium: evidence from aequorin-loaded ferret ferret ventricular muscles." J. Clin. Invest. 93. 1275-1284 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Sasayama S.: "1-Methionine augments myocardial contraction by sensitizing myofilament for calcium" Circ. Res. 77. 80-87 (1995)
• [Publications] Sasayama S, Asanoi H, Kihara Y, Yokawa S, et al.: "Clinical effects of long-term administration of pimobendan in patients with moderate-congestive heart failure." Heart and Vessels. 9. 120-133 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Inoko M, Hatakeyama N, et al.: "Mechanisms of negative inotropic effects of class Ic antiarrhythmic agents: comparative sutdy of the effects of flecainide and pilsicainide on intracellular calcium handling in the dog" J. Cardiovasc. Pharmacolog.27. 42-51 (1996)
• [Publications] Inoko M, Kihara Y, Fujiwara H, Sasayama S.: "Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats." Am. J. Physiol. 267. H2471-H2482 (1994)
• [Publications] Inoko M, Kihara Y, Sasayama S.: "Neurohumoral factors during transition from left ventricular hypertrophy to failure in Dahl salt-sensitive rats" Biochem. Biophys. Res. Commun.206. 814-820 (1995)
• [Publications] Sasayama S, Asanoi H, et al.: "Diastolic Relaxation of The Heart, 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers" Grossman W. and Lorell BH, des., 8 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Sasayama S: "Proceedings of Oji International Seminar on the Pathophysiological Roles of Intracellular Calcium Ion." Kusuoka H and Marban E, eds., 5 (1994)