1995 Fiscal Year Annual Research Report
培養血管内反細胞の細胞内レドクス応答を指標とした抗循環器病薬探索法の開発
Project/Area Number |
07557374
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Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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Research Institution | Showa University |
Principal Investigator |
野瀬 清 昭和大学, 薬学部, 教授 (70012747)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 外志張 明治乳業, ヘルストサイエンス研, 副所長
山元 俊憲 昭和大学, 薬学部, 助教授 (30112741)
真下 順一 昭和大学, 薬学部, 助手 (60054045)
江川 清 昭和大学, 薬学部, 講師 (00095879)
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Keywords | レドクス / 遺伝子発現 / WAF-1 |
Research Abstract |
薬物検索法の開発のために、遺伝子発現にレドクス制御が関与するサイトカインJE遺伝子および癌抑制遺伝子p53の標的WAF-1遺伝子に注目した。これらの遺伝子エンハサ-を用い、その活性を指標として新規薬物の検索法の確立を試みた。まず、JE遺伝子5'上流をCAT遺伝子に連結したベクターを培養細胞に導入し、種々の薬物でJE遺伝子転写の上昇を見たところ、非特異的に誘導され、スクリーニング法としては不適当と思われた。次に、増殖停止に関わるWAF-1遺伝子エンハンサーを用い、同様な検討を行った。ヒトWAF-1遺伝子の5'上流2.4KbのDNA断片をレポーターとしてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子に連結し、発現レポーターを構築した。この発現レポーターをp53の欠損したヒト骨芽細胞(Saos-2細胞)およびp53ノックアウトマウスの線維芽細胞に野生型p53または変異型p53と共に導入して、それぞれの転写活性を調べた。その結果、WAF-1エンハンサーは野生型p53では活性されるが、p53^<Cys270>, p53^<Val134>ではほとんど活性化されなかった。この系は変異型p53を正常化させる薬物の探索に利用できると思われる。また、これらの細胞にこの発現レポーターを導入し、安定に遺伝子を組み込んで形質転換細胞株を分離した。この樹立した細胞を用い、予備実験として数種類の薬剤で刺激してエンハンサー活性を調べたところ、細胞内にレドクス変化を与えるジエチルマレートに誘導活性がみられ、WAF-1エンハサ-にはp53非依存性の転写エレメントが含まれていることが明らかとなった。以上の結果、薬剤によるこのエレメントの活性変化を調べることにより、新規抗腫瘍薬剤の探索が可能になると思われる。また、この系の探索法の特異性や感度を高めるために、p53に反応するエレメントおよびp53非依存的に活性化されるエレメントの領域をWAF-1からエンハサ-を制限酵素で分画し、それぞれをレポーターに連結したプラスミドも構築している。
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Research Products
(3 results)
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[Publications] 荒田 悟: "Effect of the overexpression of the small heat shock protein, HSP27, on the sensitivity of human fibroblast cells exposed to oxidative stress" J. Cell. Physil.163. 458-465 (1995)
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[Publications] 柴沼 質子: "Activation of DNA synthesis and expression of the JE gene by catalase in mouse in osteoblastic cells.: Possible involvement of hydrogen peroxide in negative growth reguration." Exp. Cell. Res.218. 132-136 (1995)
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[Publications] 江川 清: "Isolation of a novel ras-recision gene that is induced by hydrogen peroxide from a mause osteoblastic line, MC3T3." FEBS Lett.372. 74-77 (1995)