真核生物染色体DNA複製蛋白複合体の多量発現ベクター開発と簡易精製法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07558101
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 正井 久雄 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (40229349) ; 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885) ; 伊藤 建夫 信州大学, 理学部, 教授 (40051817) ; 真木 寿治 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (20199649) ; 真木 智子 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60212205)
• Keywords: DNA複製複合体 / 多量発現ベクター / バキュロウイルスベクター / 昆虫細胞 / YACベクター / Cdc7-Dbf4複合体 / RFC複合体

Research Abstract

出芽酵母染色体DNA複製蛋白複合体であるCdc7-Dbf4 protein kinaseをバキュロウイルスベクターを使用し、昆虫細胞内で多量発現することに成功した。この系は以前は別々の遺伝子を個別にベクターに組み込み同一細胞に導入し発現させる方法がとられたが、本研究では二つの遺伝子を連結して同一ベクターに組み込んだもので、ベクターが導入された細胞を選別する時間の節約がなされたところに以前の方法に比較して有利な点がある。同様の方法で出芽酵母RF-C複合体(五つの異なったサブユニット、Cdc44,Rfc2,Rfc3,Rfc4及びRfc5蛋白からなる)の多量発現を試みたがベクターに組み込むDNAの長さが非常に大きくなり、また一部のDNA断片が大腸菌にとって有害のため目的とする発現ベクターの構築が不成功に終わった。従って現在YACベクターを使用し五つの異なった遺伝子からなる単一オペロンからなる発現系を開発中である。目的とするベクターが構築できれば大腸菌内で増幅することをしないで直接、酵母菌に導入し、RFC複合体の多量発現が期待できる。

Research Products

• [Publications] Sugimoto,K.,et al.: "RFC 5,a small subunit of replication factor C complex,couples DNA replication and mitosis in budding yeast." Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.92(in press). (1996)