ランダムプライマーを用いたPCR法による細胞特異的遺伝子同定の高効率化

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07558104
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 遠山 正彌 大阪大学, 医学部, 教授 (40028593)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今泉 和則 田辺製薬株式会社, 応用生化学研究所, 研究員 ; 塩坂 貞夫 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90127233) ; 高木 勉 大阪大学, 医学部寄附講座, 客員助教授 (10252686) ; 島田 昌一 大阪大学, 医学部, 助教授 (20216063) ; 和中 明生 大阪大学, 医学部, 助教授 (90210989)
• Keywords: ディファレンシャルディスプレイ法 / mRNA / ランダムプライマー / プログラム細胞死 / 遺伝子クローニング / 強制発現

Research Abstract

我々はdifferential display法(以下DD法)の高効率化及び簡便化を目指し、本試験研究において改変改良を行ってきた。我々が行った改良点は主にプライマーの設計である。Liang&Pardee等による原法ではランダムプライマーとオリゴdTプライマーの組み合わせでmRNAを増幅するものであったが、これではmRNAの3'末端が頻繁に増幅されることになり情報として偏りが出てくるきらいがあった。我々はこの点を克服する目的でランダムプライマー1本を用いて増幅することを考えた。この際問題となるのはプライマーの長さであるが、我々はいろいろな長さのプライマーを試すことによりこの点についての検討を行った。10merから25merまでのプライマーの中で最も適当な数のバンドが増幅されたのは、18-22merの大きさのプライマーであった。我々はさらにこの方法で実際に遺伝子取得を試みた。モデルとしては上頚部交感神経節の培養系において神経成長因子を枯渇させた時に起こるプログラム細胞死を取り上げた。これはこの細胞死が新規遺伝子の合成を伴うことがよく知られており、かつこの系が微量の遺伝子しか取り扱えないことからDD法が好適な実験系と考えたからである。我々は20merのランダムプライマー計20本を用いて神経成長因子枯渇後に発現上昇する遺伝子を検索したところ、我々がDP5と名付けた遺伝子を同定した。DP5の全長cDNAを取得し構造決定を行った所、全く新規の遺伝子であることが判明した。またこの全長cDNAを発現ベクターに組み込み、上頚神経節細胞にマイクロインジェクションして強制発現させると、神経細胞はプログラム細胞死の形態をとって死滅した(今泉ら論文投稿中)。以上の結果我々の開発したランダムプライマーのみを用いるDD法は極微量のmRNAを同定するのに威力を発揮する方法であると考えた。