1996 Fiscal Year Annual Research Report

3液混合迅速ロ過装置の試作と実用化

Research Project

Project/Area Number	07558220
Research Institution	HOKKAIDO UNIVERSITY
Principal Investigator	谷口和弥北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204)
Keywords	キナーゼ / 胃壁H^+ポンプ / ATPase / リン酸化 / 脱リン酸化 / カルシウムイオン / Na^+ポンプ
Research Abstract	1)ブタ腎Na^+,K^+-ATPaseをNa^+存在下50mM Pyridoxal 5'-diphospho-5'-adenosine (AP_2PL)で処理して得られた標品はAP_2PL probeをα鎖のLys^<480>に〜0.5/α含みNa^+に依存したATPからのEP形成能は5お%に低下した。この標品をさらにfluorescein 5'-isothiocyanateで処理するとATPからのEP形成能は5%以下に低下したがacetylphosphateからのそれはほとんど影響を受けなかった。Mg^<2+>存在下のNaE_1へ種々の濃度のATPを添加すると、AP_2PL蛍光の速やかな減少後緩慢な増加が観察されたが、FITC蛍光の変化は検出されなかった。一方KE_2へNa^+と種々の濃度のATPを添加すると同様なAP_2PL蛍光の2相性の変化が生じたがFITC蛍光の変化は単相性でextentもrateも〜mM ATPで飽和した。以上の結果はLys^<480>に結合したAP_2PL probeがNa^+, K^+-ATPaseの同時に存在する各々2種類の高親和性部位と低親和性部位へのATP結合を認識することを示唆している。α鎖当たりのEP量、AP_2PL, FITC,及びOuabain結合量からNa^+, K^+-ATPaseの機能的単位は(αβ)_2もしくは(αβ)_4と推定される。 2)新規に見い出したブタ胃H^+, K^+-ATPaseα鎖のTyr^0とTyr^7の他にSer^<27>が酵素標品中のkinasesによりリン酸化されることを証明した。またSer^<27>のリン酸化が酸分泌刺激によって上昇するとされるCa^<2+>に依存することも見い出した。Ser^<27>は内因性のSer-kinaseのみならず、外部から加えたC-キナーゼ及びA-キナーゼによってもリン酸化された。これらTyr及びSerのリン酸化は可逆的で内在するフォスファターゼで脱リン酸化された。リン酸化反応のCa^<2+>濃度依存性、C-キナーゼの活性化因子の効果及び抗C-キナーゼ抗体との反応性から、内因性のSer-キナーゼはC-キナーゼであると結論した。一方、Tyr-キナーゼをCHAPSで可溶化後、精製を試み、一次構造をcDNA側から決定することを試みている。部分精製標品の分子量はゲルろ過カラム及び活性染色の結果から、約分子量5万と推定された。Maltose binding proteinとH^+、K^+-ATPaseα鎖のGly^2からGln^<111>を含むpeptide部分からなる融合蛋白とその変異蛋白を用いた実験から、上記kinasesによるvanadate存在下でのリン酸化には細胞質に存在するH^+, K^+-ATPaseα鎖のN-terminalを含む最初のsoluble domainで充分であること、又Tyr^7のリン酸化にはTyr^<10>のリン酸化が必須であることも示された。 3)現在、H^+, K^+-ATPaseのキナーゼリン酸化の有無を種々の蛍光プローブで処理したNa^+,K^+-ATPase標品の示すイオンの閉塞を、本研究で完成したロ過装置を用いて開始したところである。

Research Products
(4 results)

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All Publications (4 results)

[Publications] K. Togawa: "Ser27, Tyr10 and Tyr7 in the α-Chain of Pig Stomach H^+ K^+ -ATPase as Ca^<2+> Dependent Phosphorylatable sites by Intrinsic and Extrinsic Protein Kinases" Biochem. Biophys. Res. Commun.227. 810-815 (1996)
[Publications] T. Tsuda: "Are pyridoxal and Fluorescein Probes in Lysine Residues of α-Chain in Na^<2+>, K^+-ATPase Sensing ATP Binding?" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)
[Publications] Jeffrey P. Freohlich: "Complex Kinetic Behavior in the Na, K- and Ca-ATPases ; Evidence for Subunit-subunit Interactions and Energy Conserbation During Catalysis" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)
[Publications] Katsuhiko Togawa: "Phosphorylation of Tyr^7, Tyr^<10> and Ser^<27> of α Chain in H^+, K^+-ATPase by Intrinsic and Extrinsic Kinases" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)

1996 Fiscal Year Annual Research Report

3液混合迅速ロ過装置の試作と実用化

Principal Investigator

谷口 和弥 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204)

Research Products

[Publications] K. Togawa: "Ser27, Tyr10 and Tyr7 in the α-Chain of Pig Stomach H^+ K^+ -ATPase as Ca^<2+> Dependent Phosphorylatable sites by Intrinsic and Extrinsic Protein Kinases" Biochem. Biophys. Res. Commun.227. 810-815 (1996)

[Publications] T. Tsuda: "Are pyridoxal and Fluorescein Probes in Lysine Residues of α-Chain in Na^<2+>, K^+-ATPase Sensing ATP Binding?" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)

[Publications] Jeffrey P. Freohlich: "Complex Kinetic Behavior in the Na, K- and Ca-ATPases ; Evidence for Subunit-subunit Interactions and Energy Conserbation During Catalysis" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)

[Publications] Katsuhiko Togawa: "Phosphorylation of Tyr^7, Tyr^<10> and Ser^<27> of α Chain in H^+, K^+-ATPase by Intrinsic and Extrinsic Kinases" Ann. New York, Acad. Sci.(in press). (1997)

谷口和弥北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204)