新規キメラ酵素作製法の開発とその応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07558224
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 倉光 成紀 大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 増井 良治 大阪大学, 理学部, 教務員 (40252580) ; 加藤 龍一 大阪大学, 理学部, 助手 (50240833)
• Keywords: キメラ遺伝子 / キメラ酵素 / 相同的組換え / アミノ基転移酵素 / アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / 芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素 / 基質認識機構 / 基質特異性

Research Abstract

アミノ基転移酵素の特異な基質特異性を解析するために,新たな方法論の開発が必要となった。そのために,キメラ酵素作製法の蛋白質工学への適用範囲の検討を行った。
キメラ酵素を作製する方法には,大別して3つある。「制限酵素法」は共通の制限酵素部位を必要とし,「PCR法」はキメラ毎にプライマーDNAを合成する必要があるのでコストがかかる。しかし,「相同的組換え法によるキメラ作製法」は,制限酵素部位やプライマーDNAを必要とせずに,一連のキメラ遺伝子を作製できる。この方法を利用すれば,全体の塩基配列の相同性が50%以下でも,部分的に相同性の高い箇所(10塩基中8塩基以上の相同性)があれば,キメラ遺伝子の得られることが,部位特異的変異法によってDNAの相同性を部分的に変化させた実験より,明らかになった。
また,この「相同的組換え法によるキメラ作製法」利用して,制限酵素やPCR法を用いること無く,2つの遺伝子を連結する方法の開発が可能となった。
さらに,このようにして得られたアスパラギン酸アミノ基転移酵素と芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素のキメラ酵素から,両酵素は酸性基質用と疎水性基質用の2つの基質結合ポケットを持ち、基質によって2つのポケットを使い分けていることが明らかになった(但し,触媒基は共有)。また,疎水性基質認識には蛋白質の揺らぎが大きな役割を担っていることも明らかになった。

Research Products

• [Publications] Kawaguchi,S.: "Separation of Heat-Stable Proteins from Thermus thermophilus HB8 by Two-Dimensional Electrophoresis" Electophoresis. 16. 1060-1066 (1995)
• [Publications] Kuramitsu,S.: "Database of Heat-Stable Proteins from Thermus thermophilus HB8" Protein Eng.8. 964- (1995)
• [Publications] Kawaguchi,S.: "Homologous Ligation" Protein Eng.8. 965- (1995)
• [Publications] Okamoto,A.: "An Aspartate Aminotransferase from an Extremely Thermophilic Bacterium,Themus thermophilus HB8" J.Biochem.119. 135-144 (1996)
• [Publications] Takamatsu,S.: "Mismatch DNA Recognition Protein from an Extremely Thermophilic Bacterium,Thermus thermophilus HB8" Nucleic Acids Res.24. 640-648 (1996)
• [Publications] Kato,R.: "ATPase Activity of UvrB Protein from Thermus thermophilus HB8,and Its Interaction with DNA" J.Biol.Chem.(in press). (1996)
• [Publications] 倉光成紀: "分子生物学の展開,第6巻「アミノ基転移酵素」" 朝倉書店,東京(印刷中),