DNAシークエンサーによるin vivoゲノム機能領域解析法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07558229
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小布施 力史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00273855) ; 白髭 克彦 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (90273854) ; 吉川 寛 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (70019876)
• Keywords: in vivo フットプリンティング / 酵母染色体 / 複製開始点 / DNA結合蛋白質

Research Abstract

染色体上の調節領域の機能を解析するため、細胞の中(in vivo)で、その領域にどのような調節因子が結合しているか、あるいはその領域のクロマチン構造はどうであるかを知ることが必要になる。このためDNAシークエンサーを使って細胞内のゲノムの調節機能領域の状態を直接解析するin vivoフットプリンティング法の開発を行う。この技術的問題点を解決するためのモデル系として、出芽酵母の第6染色体複製開始点とそれに結合する蛋白質の挙動を解析することとした。その結果、以下に示す成果を得た。
1.モデル系とする出芽酵母複製開始点(ARS1)について、放射標識したプライマーを使う従来法で、DNA増幅反応により、ゲノム当たり1コピーであっても再現性よくフットプリンティングのパターンを出すことが出来る条件の検討を行った。酵母の処理法、DNAの精製法、DNA増幅法の検討を行った結果、再現良くARS1に結合する複製開始点識別蛋白質の結合パターンを提示する条件を確立した。DNAシークエンサーでのパターン解析には、蛍光標識したプライマーDNAを使用するが、その感度が放射標識と対等になるように、蛍光標識プライマーによる条件の検討中である。
2.結合のパターンを解析するポジティブコントロールとして、精製された複製開始点識別蛋白質が必要となる。そこでその遺伝子をクローニングし、酵母およびバキュロウイルスで発現する系を構築した。
3.得られる複製開始点のフットプリンティングのパターンの変動と複製開始点の特性を対比させるため、各複製開始点の複製開始様式の検討を行い、それぞれの複製開始点識別蛋白質への依存性の度合いを明らかにした。
これらに基づいてDNAシークエンサーを使って出芽酵母の第6染色体の9個の複製開始点のフットプリンティングのパターンを比較検討できる系の確立をめざしている。

Research Products

• [Publications] Fukuda,K.: "Structure-Function relationship of the eukaryotic DNA replication factor,Proliferating Cell Nuclear Antigen" J.Biol.Chem.270. 22527-22534 (1995)
• [Publications] Hori.Y: "Characterization of a novel CDC gene(ORC1)partly homologous to CDC6 of Saccharomyces cerevisiae" Mol.Biol.Cell.(in press).