1996 Fiscal Year Annual Research Report
DNAシークエンサーによるin vivoゲノム機能領域解析法の開発
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07558229
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| Research Institution | NARA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY |
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Principal Investigator |
釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小布施 力史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00273855)
白髭 克彦 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (90273854)
吉川 寛 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (70019876)
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| Keywords | in vivoフットプリンティング / 蛍光プライマー / DNAシークエンサー / DNA結合蛋白質 / クロマチン構造 / 酵母染色体 / 複製開始点 |
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| Research Abstract |
染色体上の調節領域の機能を解析するため、細胞の中(in vivo)で、その領域にどのような調節因子が結合しているか、あるいはその領域のクロマチン構造はどうであるかを知ることが必要になる。しかもゲノム上の広い領域にわたって解析をするためには、簡便で再現性がよく解析の自動化が可能な系が必要である。そこでDNAシークエンサーを使って細胞内のゲノムの調節機能領域の状態を直接解析するin vivoフットプリンティング法の開発を行った。その結果以下の成果を得た。
1.酵母複製開始点の蛋白質複合体をモデルとして、放射活性標識レベルでゲノム当たり1コピーのDNA配列上で再現よくフットプリンティングできる方法として、紫外線照射によるピリミジン2量体形成による解析系を確立した。
2.この放射活性標識レベルで得られたフットプリンティングの条件等の基礎データーを基に、DNAシークエンサーで同じ実験を行う場合の検出感度をバンド当たり0.1-0.5fmolであると概算できた。この量は、蛍光色素Cy5とその検出に対応したALFexpress(Pharmacia社)で求めた検出感度0.3fmolと同レベルであった。
3.この検出系と紫外線照射フットプリンティング法の組み合わせにより、酵母複製開始点の蛋白質-DNA複合体の解析を行った。その結果、5倍量のサンプルを用いることで放射性同位元素標識試料に匹敵するシグナルの検出能力を達成した。得られたフットプリンティングのパターンも放射活性標識によるものと同じものが得られた。
4.データ解析能力では、DNAシークエンサーの方が定量性、解析可能領域の広さという点で従来の方法より高い能力を示し、染色体機能の新しい解析法として期待できる。
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