Zymomonas細菌糖代謝系酵素の機能改変と高度利用に関する研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07650959
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 簗瀬 英司 鳥取大学, 工学部, 助教授 (20158033)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 喜多 恵子 鳥取大学, 工学部, 助教授 (70234226)
• Keywords: 糖転移酵素 / バイオポリマー / 配糖体 / フルクトシルトランスフェラーゼ / ランダム変異 / 部位特異的変異 / オリゴ糖 / レバンスクラーゼ

Research Abstract

アルコール醗酵性細菌であるZymomonas mobilisはスクロースを基質として高重合度のフルクタン(レバン)生成を触媒する糖転移酵素(フルクトシルトランスフェラーゼ,EC2.4.1.10,FTase)を菌体外に分泌する.本酵素は,糖転移,糖鎖伸長,および分枝を伴う糖鎖重合反応を示す多機能酵素であり,既にバイオポリマー合成の触媒素子としての高い評価を得ている.また,本酵素はフルクトシル基転移受容体特異性が広く,種々のヘテロフルクトオリゴ糖の合成に適している.
本研究では,タンパク質工学的手法を用いて糖転移酵素の転移機能と構造的特徴を明らかにするとともに,機能性糖質生産に適したFTaseの創製を目的とし,下記の成果を得た.
1)ランダム変異導入による機能ドメインの推定:FTase遺伝子にランダム変異を導入し,糖転移活性や基質特異性が著しく変化した変異酵素を取得した.変異酵素の酵素化学的性質を検討し,FTaseに糖鎖伸長ドメイン,基質の認識ドメイン,触媒ドメイン,分泌ドメインをそれぞれ推定した.2)推定した触媒ドメインへの部位特異的変異導入による構造・機能相関の解析と転移機能の改変:ランダム変異の結果をもとに,触媒ドメインと推定した領域内に保存される3種のアミノ酸残基Ser295,His296,His297に変異を導入して,アミノ酸置換による反応特性の変化を検討し,それぞれのアミノ酸残基の役割を明らかにした.3)改変酵素による転移糖合成への利用:ランダム変異酵素やアミノ酸置換酵素は糖転移活性や糖鎖伸長活性に野生型酵素とは異なる特性を示し,これら改変酵素を用いた低分子フルクタンやオリゴ糖合成を可能にした.

Research Products

• [Publications] Hideshi Yanase: "Cloning and characterization of Zymomonas mobilis gene encoding extracellular levansucrase and invertase genes" Biosci.Biotech.Biochem.59. 289-293 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Cloning,Sequence analysis,and expression of the gene encoding formadehyde dismutase from Pseudomonas putida F61" Biosci.Biotech.Biochem.59. 197-202 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "A recombinant human hemoglobin with asparagine 102(b)substituted by alanine has a limiting low oxygen affinity,reduced marginally by chloride" Protein Science. 4. 21-28 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Enzymatic Preparation of [1,3-13C]dihydroxyacetone phosphate from[13C]methanol and hydroxypyruvate using the methanol-assimilating system of methylotrophic yeasts" Appl.Microbiol.Biotechnol.43. 228-234 (1995)
• [Publications] 簗瀬 英司: "Zymomonas属細菌にみる新しい酵素分泌機構" バイオサイエンスとバイオインダストリー. 53. 35-36 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Purification,Crystallization,and Characterization of the Extracellular invertase from Zymomonas mobilis" J.Ferment.Bioeng.79. 367-369 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Properties of poly(3-hydroxybutyrate)depolymerase from a marine bacterium,Alcaligenes faecalis AE122" Appl.Environ.Microbiol.61. 1727-1730 (1995)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Random mutation of levansucrase gene(sucZE2)from Zymomonas mobilis" Abstract of Papers,Annual Meeting of Japan Society for Bioscience,Biotechnology,and Agrochemistry. 69. 86 (1996)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Site-directed mutagenesis of levansucrase gene(sucZE2)from Zymomonas mobilis" Abstract of Papers,Annual Meeting of Japan Society for Bioscience,Biotechnology,and Agrochemistry. 69. 86 (1996)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Expression of Zymomonas zliS gene that enhaces secretion of a enzyme via non-GSP in Escherichia coli" Abstract of Papers,Annual Meeting of the Society for Fermentation and Bioengineering. 308 (1996)
• [Publications] Hideshi Yanase: "Cloning and sequence analysis of the gene encoding 3-hexulose-6-phospahte synthase from the methlotrophic bacterium,Methylomonas aminofaciens 77a,and its expression in Escherichia coli" FEMS Microbiology Letters. 135. 201-205 (1996)
• [Publications] 簗瀬 英司: "フルクトシルトランスフェラーゼ(FTase)の触媒ドメイン解析と糖転移機能改変" 応用糖質科学. (印刷中).