遺伝子標識法を用いた植物土壌病原菌のモニタリングシステムの開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07660065
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 豊田 秀吉 近畿大学, 農学部, 助教授 (00150805)
• Keywords: Fusarium oxysporum / 遺伝子標識法 / エレクトロポーレーション法 / β-グルクロニダーゼ遺伝子 / in situ hybridization / ハイグロマイシン抵抗性遺伝子 / 緑色蛍光タンパク質遺伝子 / ルシフェラーゼ遺伝子

Research Abstract

本年度の研究においては、マーカー遺伝子で標識した病原菌を用い、土壌および宿主植物感染後の挙動を解析した。実際には、Fusarium oxysporumの異なる分化型菌でるトマト萎ちょう病菌、メロンつる割病菌、ホウレンソウ萎ちょう病菌およびイチゴ萎黄病菌を用い、それぞれに異なる標識遺伝子を導入した。標識とする遺伝子には、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子に加え、緑色蛍光タンパク質遺伝子の使用についても検討した。これらの遺伝子導入とその発現検出については、エレクトロポーレーション法と後述する組織内ハイブリダイゼーション法(in situ hybridization)を用いた。遺伝子標識したそれぞれの病原菌は閉鎖温室内の土壌に投入し、一定時間後にそれぞれの宿主植物を定植して、土壌ならびに植物体からそれぞれの病原菌を同時検出した。検出法としては、インドール類縁化合物に対する感受性差異と導入遺伝子のmRNAを組織内ハイブリダイゼーション法で検出した。ハイブリダイゼーションに用いるプローブにはそれぞれ異なる蛍光色素を結合させたことから、蛍光顕微鏡により容易かつ正確にそれぞれの遺伝子標識病原菌を識別できた。なお、これらの実験はすべて組み換え植物用閉鎖温室で行うので、野外への流失は全くなく、また、実験終了後はすべてオートクレイブにより滅菌処理を施したので、安全上の問題も生じていない。以上、3年間の研究において、表題のシステムが確立されたものと考えた。

Research Products

• [Publications] 松田克礼: "In situ PCR technique based on pricking microinjection for cDNA cloning in single cells of barley coleoptile and powdery mildewpathogen." Plant Cell Reptorts. 16. 612-618 (1997)
• [Publications] 豊田秀吉: "Evaluation of stable resistance expression in self-pollinated progenies of bacterial wilt registant regenerants obtained from leaf callus of tomato." Plant Biotechnology. 14. 105-110 (1997)
• [Publications] 豊田秀吉: "Gene expression in tomato for glucosylation of indole-3-propionic acid,a selective antibacterial agent against a bacterial wilt pathogen,Pseudomonas solanacearum." Plant Biotechnology. 14. 111-116 (1997)
• [Publications] 松田克礼: "メロン毛状根の縁化誘導条件の検討" 生物環境調節. 35. 131-134 (1997)
• [Publications] 道後充恵: "3-インドールプロピオン酸(IPA)による水耕栽培トマトの青枯病防除とトマト組織におけるIPAの無毒化" 日植病報. 63. 406-408 (1997)