1996 Fiscal Year Annual Research Report
ミツバチ由来のアピデシンをモデルとした抗菌ペプチドの実験室内進化
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07660122
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
百瀬 春生 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (30219993)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 精一 東京理科大学, 基礎工学部, 助手 (70216828)
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| Keywords | アピデシン / 抗菌ペプチド / 実験室内進化 / ランダム突然変異 / in vivoスクリーニング系 / in vivoアッセイ系 / 抗菌スペクトル / 活性変異体 |
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| Research Abstract |
本研究は、ミツバチ由来の抗菌ペプチドで、18アミノ酸残基からなる"アピデシン"(apidaecin)に着目し、これを動植物への感染防止や、食品保存に応用するためのモデル抗菌ペプチドと位置づけ、実験進化の手法を開発することを目的としている。前年度には、アピデシン遺伝子に対してヒドロキシルアミンとPCRによる限定域in vitroランダム突然変異と、in vivoアッセイ・スクリーニング系を組み合わせた独自の方法(本来アピデシン感受性大腸菌の宿主ベクター系であえて変異アピデシンを発現させ、活性変異体を分離できる)を駆使し、多数の低活性変異体を得、アピデシン分子の機能マッピングを行うと同時に、in vivoとin vitroでの活性評価の一致を確認した。本年度は、これらの実績をもとに次のような成果を得た。
1.高活性変異体のデザインをより容易にするため、アピデシン遺伝子を2つタンデム(正逆それぞれ)に連結し、発現ベクターを構築した。2.高活性変異体が上記in vivoスクリーニング系で出現したとき、野生型活性体が死滅し、それより高活性の変異体のみが生存できるような実験系として「アンピシリンスクリーニング系」を組み、それによって約1000倍の効率で高活性変異体の選抜が実現することを確認した。3.アピデシンの抗菌スペクトルに関し、グラム陰性菌に効き、陽性菌には効かないとの従来の知見に対し、陽性菌でも効く場合のあることを、枯草菌の特殊株を用いて証明した。4.アピデシンの抗菌作用との比較研究のため、カメムシ由来のサナチン(21アミノ酸残基からなり、グラム陰性菌、陽性菌、真菌のいずれにも作用)の遺伝子を化学合成し、プロテアーゼインヒビター"SSI"の遺伝子と融合後、上記in vivoアッセイ系に組み込んだ。次年度には、これらの成果を活用して、高活性変異や抗菌スペクトル変異体への実験進化に向けた研究を展開する。
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[Publications] Mahito Terabe: "A subtilisin inhibitor produced by Streptomyces bikiniensis possesses a glutamine residue at reactive site P1" J.Biochem.117. 609-613 (1995)
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[Publications] Seiichi Taguchi: "Extracellular protease inhibitors and their target enzymes in Streptomyces" Proc.Int.Symp.Biol.Actinomycetes. 9. 169-171 (1995)
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[Publications] Seiichi Taguchi: "Taxonomic characterization of closely related Streptomyces spp.based on the aminoacid sequence analysis of Proteace inhibitor" FEMS Microbiol.Lett.135. 169-173 (1996)
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[Publications] Mahito Terabe: "New subtilisin-trypsin inhibitors produced by Streptomyces : primary structure and their relationship to other inhibitors" Biochim.Biophys.Acta. 1292. 233-240 (1996)
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[Publications] Akinori Kuramoto: "The location and deletion of the genes which code for SSI-like protease inhibitors in Streptomyces by pulse-field gelelectrophoresis" FEMS Microbiol.Lett.139. 37-42 (1996)
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[Publications] Seiichi Taguchi: "Functional mapping of amino acid residues responsible for the antibacterial action of apidaecin" Appl.Environm.Microbiol.62. 4652-4655 (1996)
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[Publications] 百瀬春生(編著): "微生物工学" 丸善株式会社, 166 (1997)
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[Publications] 百瀬春生(共著): "分子生物学" 放送大学出版協会, 211 (1997)
