緑膿菌アルカリプロテアーゼのプロセシング、活性化及び分泌に関する分子遺伝学的研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07660126
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: University of East Asia
• Principal Investigator: 森原 和之 東亜大学, 工学部, 教授 (80230142)
• Keywords: 部位特異的変異 / 緑膿菌アルカリプロテアーゼ(AP) / Kunkel法 / Western blotting / AP分泌発現系 / PCR法

Research Abstract

1)Kunkel法による部位特異的変異
AP構造遺伝子、1.9KbフラグメントをpUC19(2.67Kb)とライゲートして構築したpAPE1を、Ps1-Kpn1消化、得られた1.3Kbフラグメント(AP構造遺伝子)をm13mp19(7.25Kb)とライゲートしてmp19APKP(9.10Kb)を構築。タカラキットを用いてKunkel法により以下の部位特異的変異を行った。
H-176L,E-177Q,D-356A,D-365A
(アミノ酸番号の右側に変換するアミノ酸の種類を示す)
構築した変異AP遺伝子を用いて、大腸菌にて形質転換後、菌体抽出液についてプロテアーゼ活性の測定を行い、いずれも活性の消失を認めた。H-176及び E-177が酵素活性に関与することを支持する。一方、D-356とD-365はCaと結合してβ-構造を保持しているが、その構造破壊は酵素活性の消失に関連するようである。Westernblottingの結果,APよりやや分子量の大きいあるいは小さいスポットを見い出した。それら蛋白とAPとの関連については現在検討中である。
2)大腸菌でのAP分泌発現系の構築
APの分泌に必要なaprD,aprE,aprF,aprAを含むDNA断片をクローニングし、APの大腸菌での分泌発現系を構築した。aprDとaprEを含むフラグメントはPCR法によって調製した。一方、aprFとaprAを含むフラグメントはプラスミドpASP93より常法により調製した。両フラグメントはライゲーションした後pUC18に挿入、E. coliJM109を用いて形質転換する。現在、分泌の有無について検討中である。