細胞運動および形質膜イオン移動における蛋白質脱燐酸化過程の調節的役割の解明

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670052
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高井 章 名古屋大学, 医学部, 助教授 (50126869)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 徳納 博幸 名古屋大学, 医学部, 助手 (60155520)
• Keywords: プロテインフォスファターゼ / オカダ酸 / 蛋白質リン酸化 / 平滑筋 / ト-トマイシン

Research Abstract

1.代表的なPP阻害剤であるオカダ酸が、健常な細胞膜をもつ各種平滑筋においては、張力発生とミオシン軽鎖燐酸化を強力に抑制するという一見逆説的な効果を示す。PPlにオカダ酸よりも高い親和性を示すPP阻害剤tautomycinは、健常な膜をもつ平滑筋においても張力発生増強とミオシン軽鎖燐酸化上昇を起す。今回、オカダ酸がこのtautomycinによる張力増強をきわめて強く抑制することを見いだした。ミオシン燐酸化上昇効果もオカダ酸により著明な抑制を受けるが、張力発生がほぼ完全に抑制される場合にも、相当に高い燐酸化レベルが保たれていた。平滑筋活性化の経路には、燐酸化により抑制を受ける複数のステップが存在するらしい。
2.ウシ毛様体の単離平滑筋細胞においてパッチクランプ法による実験を行い、典型的なCa^<2+>依存性K^+チャネル(BK)の存在することを確認した。ムスカリンM_3受容体の刺激に伴い、非特異性陽イオンチャネルの活性化によると思われる脱分極(電流固定時)または内向き電流の増加(電圧固定時)がみられたが、この際BKが二次的に活性化するのが観察された。このチャネルは、気道平滑筋などのBKとは異なり、β-作動薬の細胞外投与やcAMP依存性PKの細胞内投与によっては活性化されないことが分った。
3.ラット胸腺から得たT型リンパ球についてBCECF色素法により細胞内のpH変化を記録するとき、オカダ酸が細胞分裂促進物質や高浸透圧刺激などによる細胞内アルカリ化を増強することが分った。
4.以後の実験に使用するため、^3Hでラベルしたオカダ酸と抗オカダ酸モノクロナール抗体を調製した。生理学的実験にこれらを使用するため、純度、PP分子結合性など基本的データを得るための実験を行う必要が生じた。この作業には相当時間を消費したが、副次的な成果として、オカダ酸と他のPP阻害剤とがPP分子上の同一の結合部位に競合的に結合することを示唆する興味ある知見を得ることが出来た。

Research Products

• [Publications] FUKAMI et al.: "Activity of smooth muscle protein phosphatases 1 and 2A in rabbit basilar artery in vasospasm" Stroke. 26. 2321-2327 (1994)
• [Publications] ISOBE et al.: "New analysis method for protein phosphatase 2A inhibitors using the firefly bioluminescence system." Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 59. 2235-2238 (1995)
• [Publications] TAKAI et al.: "Inhibition of specific binding of okadaic acid to protein phosphatase.-2A by microcystin-LR,Calychlin-A and tautomycin" Biochemical Journal. 306. 657-665 (1995)
• [Publications] SUGIYAMA et al: "Molecular shape analysis and activity of fautomycin,a protein phosphatase inhibitor" Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 6. 3-8 (1996)