1995 Fiscal Year Annual Research Report
化学修飾によるロイコトリエンA_4水解酵素の活性中心の構造解析
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07670135
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Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
大石 展也 東京大学, 医学部(病), 助手 (30231195)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 孝雄 東京大学, 医学部(医), 教授 (80127092)
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| Keywords | ロイコトリエンA_4水解酵素 / アミノペプチダーゼ / 化学修飾 |
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| Research Abstract |
ヒトLTA_4水解酵素の組換え体を大腸菌において大量に発現させ、その破砕液の10000×gの上清より硫安分画、陰イオン交換・ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより、約20mgの精製酵素を調製した。この精製酵素をN-アセチルイミダゾールによってアセチル化を行ったところ、時間および濃度(N-アセチルイミダゾール対酵素のモル比)依存性に、LTA_4水解酵素活性及びアミノペプチダーゼ活性が低下することが観察された。次にN-アセチルイミダゾール処理によって活性が低下した酵素を、中性ヒドロキシルアミンと反応させると、両酵素活性はほぼ完全に回復した。さらに、酵素に、本酵素の可逆的阻害剤であるベスタチンを、酵素濃度に対して過剰量となるように予め添加しておくと、N-アセチルイミダゾール処理による両酵素活性の低下は抑制された。このことから、N-アセチルイミダソ-ルによる酵素のアセチル化によって生ずる両酵素活性の低下は、チロシン残基のアセチル化によるものであり、かつ、そのチロシン残基は、本酵素のベスタチン結合部位近傍に存在すると推定された。本酵素をテトラニトロメタンによってニトロ化することによっても、ベスタチンの場合と同様な酵素活性の変化が認められ、ベスタチン結合部位近傍に存在する特定のチロシン残基が、両酵素活性に重要な役割を果たしているものと考えられた。
今後は、その修飾によって酵素活性の低下をきたす特定のチロシン残基の数を決定すると同時に、安定な修飾酵素を作製し、修飾されるチロシン残基の部位を同定していく予定である。
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