病原真菌mRNA5'キロッピング酵素遺伝子の単離と酵素阻害剤の検索

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670408
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 土井 陸雄 横浜市立大学, 医学部, 教授 (70091585)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浦野 勉 横浜市立大学, 医学部, 助手 (00213512) ; 鹿島 勇治 横浜市立大学, 医学部, 助手 (50233705) ; 岡部 とし子 横浜市立大学, 医学部, 講師 (20152564)
• Keywords: Candida albicans / キャッピング酵素 / グアニル酸転移酵素

Research Abstract

酵母Saccharomyces cerevisiae内で複製可能なプラスミドを用いてCandida albicans genomic DNAライブラリーを作製し、グアニル酸転移酵素遺伝子をURA3並びに5FOA(5-fluoroorotic acid)を用いてS.cerevisiaeによる機能的相補性を利用して単離した。ライブラリーを導入したS.cerevisiae細胞3x10^4あたり9個の細胞が5FOA耐性を示し、これら細胞から導入されたプラスミドを単離し制限酵素地図を作製したところ全てのクローンが同一のDNA断片を組み込んでおり、5.2kbXbaI-Tth111I断片のみで5FOA耐性を示すことを明らかにした。このDNA断片の塩基配列をダイデオキシ法により決定したところ、2つのタンパク質(ORF1,ORF2)をコードし得ることが示唆された。ORF1は52kDのタンパク質をコードしておりS.cerevisiaeのグアニル酸転移酵素と39.3%の同一性並びに76.5%の相同性を示した。さらに他の酵母Shizosaccharomyces pombeのグアニル酸転移酵素とも38.2%の同一性並びに75.9%の相同性を示した。またタンパク合成開始部位の10塩基上流にはTATA配列が見出され、ノーザンブロティングにより1.6kbのmRNAが検出されたことからORF1はCandida albicans内で機能していると考えられた。次にORF1をglurathione-S-transferaseとの融合タンパク質として大腸菌を用いて大量発現し、glutathioneカラム並びにトロンビンを用いて精製した。この精製標品はα-^<32>P-GTPを用いた酵素-中間体形成反応によりCandida albicansの粗抽出液を用いた場合と同様の中間体を形成したことから、ORF1はCandida albicansグアニル酸転移酵素をコードしていると結論した。