1995 Fiscal Year Annual Research Report
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07670418
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka Prefectural Institute of Public Health |
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Principal Investigator |
加瀬 哲男 大阪府立公衆衛生研究所, 公衆衛生部, 主任研究員 (10175276)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥野 良信 大阪府立公衆衛生研究所, 公衆衛生部, ウイルス課長 (30112064)
前田 章子 大阪府立公衆衛生研究所, 公衆衛生部, 主任研究員 (40250279)
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| Keywords | アデノウイルス / ヘキソン / PCR / シークエンス / 制限酵素解析 / ウイルス同定 / 迅速診断 |
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| Research Abstract |
1)アデノウイルス全型に反応するといわれているヘキソン部位のプライマー(H exA A1885 5'-GCCGCAGTGGTCTTACATGCACATC-3'およびH exA A1913 5'-CAGCACGCCGCGGATGTCAAAGT-3')を用いて、アデノウイルス1〜8型においてポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)を94℃1分、55℃1分、70℃1分30サイクルの条件で実施し、アガロースゲルで301bpのPCR産物を確認した。
2)1)で得られたPCR産物をInvitorogen社のTAクローニングキットを用いてpCRベクターにクローニングした。操作手順はキット添付プロトコールに従った。ただし、プラスミドのトランスフェクションは電気穿孔法を用いて行った。
3)トランスフォームした大腸菌をTブロスで増殖させ、プラスミドDNAはファルマシアのEasyPrepシステムを用いて精製した。クローニングしたPCR産物はファルマシアのA. L. F. シークエンスサ-を用いて、ジデオキシ法にて塩基配列を決定した。
4)1〜8型のアデノウイルスのPCRによって得られたヘキソン部位の遺伝子解析を行った。
5)その結果、1〜8型のアデノウイルスPCR増幅部位には異なる制限酵素部位があり、4種類の制限酵素(Hae III, Hpa II, Rsa I, Mae I)を組み合わせることによって、PCR産物の消化断片が各ウイルスによって異なる可能性が示された。
6)実際、臨床分離アデノウイルス8型のPCR産物制限酵素消化断片は、標準株のそれと同じ電気泳動パターンを示し、この方法が、アデノウイルス感染症の診断に利用できる可能性を示した。
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