EPRセル内細胞培養法を用いた一酸化窒素(NO)スピントラッピング法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670535
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 谷川 徹 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (80217124)
• Keywords: EPR / 一酸化窒素(NO) / マクロファージ / 血管内皮細胞 / スピントラッピング

Research Abstract

(1)トラップの毒性の検定:トリパンブルー排除法によりMGD-鉄/HEPES-RPMIは培養マウスマクロファージに種々の濃度で4時間まで毒性を示さなかった。同様の検定を培養ヒト内皮細胞(HUVEC)についても検討した所、MGD-鉄比10:1,1mMで60分で接着面より遊離した。これは細胞間架橋に必要な金属に対して過剰のMGDがキレートとして作用した可能性が考えられる。
(2)トラップの安定性の向上:低酸素下に調整したMGD-鉄/5%FBS添加HEPES-RPMIは冷凍保存にて数か月間安定であった。用時酸素を混合して6時間まで安定にNOを測定できた。
インフュージョンンポンプを用いて恒常的にフレッシュなメデイアを流すことにより、低容量であるEPR用セル内での細胞培養(マウスマクロフア-ジ)が可能となった。同時にエフリューエントのNO_2量測定も可能となり、経時的にESRでの測定をNO_2量と対比して検討する予定である。内皮細胞の場合は細胞のサイズが大きく、またNO産生量がおそらくマクロフア-ジに比し少量であるためEPRセル内の表面積を増し、容量を減らすことによりESRシグナルを得る効率を上げる事ができる。このためビーズ表面上で培養したのちセル内に入れて測定できるようなオープンセルの開発も試みている。(4)MGD-鉄をもちい、培養用ウェル内で一定時間インキュベートし、その上清のEPRシグナルを測定した。
(MGD:N-metliylglucamine dithiocarbamate)