変異原性物質によるミトコンドリア遺伝子変異のin vivoでの基礎的検討

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670737
• Research Institution: OKINAKA MEMORIAL INSTTUTE FOR MEDICAL RESEARCH
• Principal Investigator: 中瀬 浩史 (財)冲中記念成人病研究所, 研究員 (80155738)
• Keywords: mitochondria / mutagen / PCR-SSCP / methotrexate / ethidium bromide / histochemistry

Research Abstract

目的:ミトコンドリア遺伝子異常症の病態解明の一手段としてモデル動物の開発を目的として,ミトコンドリアDNA変異を来す物質を投与してミトコンドリア遺伝子異常として挙げられている各種の物質のうち,今回はethidium bromide及びamethopterinを投与し,in vivoでのミトコンドリアDNAの変化をSSCP法で検討した。
方法:投与薬剤はethidium bromide(EtBr)及びamethopterin(MTX)を今回の実験では用いた。生後8週のB10マウス雌各々5匹にEtBr,MTXを腹腔内に投与し,隔日投与にて4週間行ない,骨格筋を採取してその組織化学的検討及びミトコンドリアDNAの検索を行った。ミトコンドリアDNAの検索にはtRNA site,D-loop reagionをPCR法で増幅し,SSCP法で検討した。PCRの条件はPHAST gel systemにより電気泳動しsilver stainingにてsingle bandであることを確認後SSCP法にて検討した。
結果:EtBr,MTXともに組織化学的には正常と変化は認められなかつた。Dot blottingによる定量では平均においてミトコンドリアDNA量が減少傾向にあったが明らかなものではなかった。SSCP法ではバンドの数が増加しており,ミトコンドリアDNAの変異の存在が示唆された。
考察:EtBr,MTXともに4週間の短期投与においてもミトコンドリアDNAにin vivoにおいても変化を来す可能性が示唆されたので,今後は妊娠ラットを用いて投与実験を行い次世代でのミトコンドリアDNAの変化を検討する必要がある。