尋常性および落葉状天疱瘡抗原遺伝子の表皮特異的発現調節機構の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670927
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 玉井 克人 弘前大学, 医学部・附属病院, 講師 (20236730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 沢村 大輔 弘前大学, 医学部・附属病院, 講師 (60196334)
• Keywords: 尋常性天疱瘡抗原 / 落葉状天疱瘡抗原 / 自己免疫性水泡症 / デスモゾーム / 転写調節因子 / 組織特異的発現

Research Abstract

1.ヒト尋常性天疱瘡抗原(Dsg3)遺伝子
ヒトケラチノサイド由来mRNAをテンプレートとし,ランダムヘキサマーDNAをプライマーとして,逆転写酵素によりケラチノサイトcDNAを作成。さらにこれをテンプレートとし,既に報告されているヒトDsg3cDNAの塩基配列を基に,PCR法(RT-PCR)にて5′末端付近の約400bpのヒトDsg3cDNA断片を作成。これをプローブとして,ヒトゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし,5つの異なるクローンを得た。これらのクローンDNAを複数の制限酵素で切断し,アガロース電気泳動した後,5′端の塩基配列を含むオリゴDNAとのサザーンハイブリダイゼーションにて最も5側の配列を含むクローンを同定,自動DNA塩基配列決定装置を用いてこのクローンの塩基配列約5kbを決定した。この塩基配列をcDNAの塩基配列と比較することにより,エクソン・イントロン構造を決定。最後に第1エクソン上流の塩基配列を基に作成したオリゴDNAをプライマーに用いてプライマー伸長法により転写開始部位を同定した。
2.マウスDsg3遺伝子
ヒトDsg3cDNA塩基配列の5′端付近で,カドヘリン遺伝子群との間で相同性の高い領域を検討し,その領域の配列からなるオリゴDNAを作成。このオリゴDNAを用い,ヒトの場合と同様,RT-PCR法にて5′端近傍約300bpのcDNA断片を得た。これをプローブとしてマウスcDNA及びゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし,マウスDsg3cDNA及びゲノムDNAクローンを単離,これらDNAの塩基配列を決定した。
3.ヒト落葉状天疱瘡抗原(Dsg1)遺伝子
ヒトDsg3遺伝子の場合と同様の手法にてヒトDsg1cDNAプローブを作成。これを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし,複数のDsg1DNAクローンを得た。