ヒトD_3ドーパミン受容体アイソフォームの発現調節および細胞内情報伝達機構

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07671093
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 松井 宏晃 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (90181685)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊野 美幸 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20203218)
• Keywords: D_3ドーパミン(DA)受容体 / ヒト神経芽細胞腫SY-5Y細胞 / 逆転写・ポリメラーゼ連鎖(RT-PCR)反応 / long PCR法

Research Abstract

ラット、マウス、ヒトD_3ドーパミン(DA)受容体cDNAの構造、およびD_2DA受容体における選択的スプライシング部位を考慮し、ヒトD_3DA受容体第3細胞質内ループのアミノ端側およびカルボキシル基末端部位に特異的な順、逆プライマーを作成し、ヒト神経芽細胞腫SY-5Y細胞の全RAMを基質に、逆転写・ポリメラーゼ連鎖(RT-PCR)反応を行った。部分的にGC含有量が多い領域が存在するためか、通常PCR反応に用いられるTaq DNAポリメラーゼでは、RT-PCR産物が得難かった。そこで、より耐熱性のPfu DNAポリメラーゼを用い、DNA変性温度を98℃に上昇させることにより、特異的なRT-PCR産物を得ることが可能となった。RT-PCR産物をアガロース電気泳動法により分離すると、予想されたヒトD_3DA受容体mRNAに由来するRT-PCR断片の他に、約100-bp分子量の小さいRT-PCR断片の、2つの断片を得た。これらの断片をゲルから、抽出し、塩基配列を決定すると、分子量の大きな断片は、既報のヒトD_3DA受容体のcDNAの構造に一致していたが、分子量の小さな断片は、既報のヒトD_3DA受容体cDNAの構造と比較すると98-ntの欠失を伴っていた。この欠失D_3DAと精神分裂病などの疾患との関連性は不明である。ヒトゲノミックDNAを5種の制限酵素で切断後、アンカーオリゴヌクレオチドを接続、ヒトD_3DA翻訳開始点付近の配列を基に作製した2種のプライマーとアンカーオリゴヌクレオチドに対するプライマーを用いたlong PCR法に準じた方法により、ヒトD_3DA受容体遺伝子5'非翻訳領域を増幅し、現在その構造解析を行っている。