1995 Fiscal Year Annual Research Report
P糖蛋白質類似多剤耐性関連蛋白質遺伝子のクローニングと単クローン抗体の作製
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07671193
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
河井 和夫 三重大学, 医学部, 講師 (60152899)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
草野 五男 三重大学, 医学部, 講師 (90126970)
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| Keywords | 抗癌剤 / 多剤耐性 / P糖蛋白質 / 遺伝子クローニング / 単クローン抗体 |
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| Research Abstract |
著者らの多剤耐性マウス白血病細胞株ではP-glycoprotein(P-gp)とhomologyを有するが、ユニークな多剤耐性関連蛋白質(P糖蛋白質類似多剤耐性関連蛋白質)が薬剤耐性度に相関して過剰に発現されていることを見い出し、ヒト多剤耐性細胞でもこの蛋白質は発現されており、種を超えて保存されていることも明らかにすることができた。高度多剤耐性マウス白血病細胞株よりcDNAを合成し、cDNA libraryを作成した。Northern blotの結果より、ヒト正常MDR1 cDNA fragment(pA1-EP)はP-gpのみならず目的の蛋白をコードするtranscriptともcrosshybridizeすることがわかっているので、これをプローブとするplaque hybridizationを行い、陽性cDNA clonesを得、それぞれよりDNAを抽出して、制限酵素処理を行い、pA1-EP及び、P-gpのcDNAとのみhybridezeするpEXI/172をプローブとして別々にサザン・ハイブリダイゼーションを行い、pA1-EPとのみhybridizeするクローンを得た。最終的に、目的の多剤耐性関連蛋白質の大部分をコードしていると考えられるcDNAクローンを数個分離することができた。その中の一つ(約1.8kb)を選び、プラスミッドベクターにサブクローニングした後、制限酵素地図を作製した。その結果はP-gpのそれとは異なっていることが判った。このクローンは制限酵素SacIにて、1.3kbと0.5kbのフラグメントにして、それぞれサブクローニングを行い、サンガー法にてsequencingを行った。現在、1.3kbフラグメントのdeletion mutants得て、残りの部位をsequencingを行っている。
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