1996 Fiscal Year Annual Research Report
P糖蛋白質類似多剤耐性関連蛋白質遺伝子のクローニングと単クローン抗体の作製
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07671193
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
河井 和夫 三重大学, 医学部, 講師 (60152899)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
草野 五男 三重大学, 医学部, 講師 (90126970)
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| Keywords | 多剤耐性 / 化学療法 / P糖蛋白質 |
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| Research Abstract |
昨年度は、高度多剤耐性マウス白血病細胞株より、cDNA libraryを作成し、modified differential hybridization法によりP-glycoprotein(P-gp)とhomologyを有するが、ユニークな多剤耐性関連蛋白質(P糖蛋白質類似多剤耐性関連蚕白質mini-P-glycoprotein(Pgp_<mini>))をコードすると考えられるクローン(λ314、約1.8kb)を得た。プラスミッドベクターにサブクローニングし(p314)、更に、SacIにて、1.3kbと0.5kbのフラグメントにして、それぞれサブクローニングを行い(p314/1.3、p314/0.5)sequencingを行った。本年度は、更にExonuclease III/Mung-Bean nucleaseを使って1.3kbフラグメントのdeletion mutants(pN13、p18、pN17)得て、残りの部位をsequencingを行った。そしてhomology searchを行った。その結果はimmunoblot並びにNorthern blotの結果より予測された様にマウスP-gpに相同性を有し、就中、mdrlaと極めてよく似た配列を有することが判った。然るに、特に、3'側に相当するp314/1.3のinsertの約70%はP-gpには全く相同性を有しない塩基配列を示すことから、P-gpのalternative splicingによるsplicing variantではなくsister geneである可能性が高いことも判明した。また、1)sequencingの結果より、P-gpとhomologyを有せず、抗原性の高いと考えられるアミノ酸配列を選択してオリゴベプチドを合成して、2)SDS-PAGEゲルよりPgp_<mini>に相当するバンドを切り出し、電気的に溶出して、それぞれ、マウスにadjuvantとともに免疫接種した後、P-gpとは反応せず、Pgp_<mini>とのみ反応するモノクローナル抗体を産生するhybridomaの作製を試みたが、目下のところ成功していない。今後は、Pgp_<mini>の機能を解明する為に、更に、上記hybridomaの作製の試みを続行するとともに、Pgp_<mini>のcDNAを野生株にtransfectionして発現させる実験を行う予定である。
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