血管内皮細胞増殖因子アンチセンスのヒトグリオーマ細胞増殖に対する効果

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07671538
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 杉山 聡 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (50154498)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松谷 雅生 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90010454)
• Keywords: 血管内皮細胞増殖因子 / 脳腫瘍 / アンチセンスオリゴ / 遺伝子治療

Research Abstract

平成7年度はヒトglioma細胞株でのVascular Endothelial Growth Factor (VEGF)発現をPCR法にて、またglioma手術摘出標本でのVEGF発現を免疫組織学的に検討した。(1)ヒトglioma細胞株T98G,U87MG,U138MGよりtotal RNAを摘出し、逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを作製した。それぞれの一本鎖cDNAをtemplateとし、primerはnucleotide residue 346から5'ACT-GAG-GAG-TCC-AAC-ATC-ACC 3'とnucleotide residue 621から5'CTT-GTC-ACA-TCT-GCA-AGT-ACG 3'を用いPCRを行った。PCR産物の電気泳動を行い、それぞれ257bpのbandを得た。以上より3つのglioma細胞株にVEGFの発現を確認した。(2)ヒトgliomaの手術摘出標本をホルマリン固定パラフィン包埋しVEGF抗体を用いてABC法にて染色した。神経膠芽腫の壊死部周辺のpalisading細胞にEGFの発現を認めた。(3)antisense oligomerを得るためにRT-PCRを行った。VEGF_<189>のfirst methyonineからsignal sequenceを含みBam HI siteをつけたsense primerとstop codonを含みX ba Isiteをうけたantisense primerを用いU87MG細胞のcDNAをtemplateとして行った。得られたPCR産物のsize 576bpを電気泳動にて確認した。VEGF cDNAをmammalian CMV-promotor expression vector pCEP4に組込んだ。現在stable transfectantを得るために、T98G, U87MG, U138MG細胞にリン酸カルシウム沈殿法を用いてtransfection中である。