ユ-イング肉腫における遺伝子治療の基礎的研究-アンチセンスEWS/Fli-1を導入して-

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07671579
• Research Institution: DEPARTMENT OF ORTHOPAEDIC SURGERY,GIFU UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
• Principal Investigator: 大野 貴敏 岐阜大学, 医学部・附属病院, 助手 (60281052)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西本 裕 岐阜大学, 医学部, 助手 (20208234)
• Keywords: ユ-イング肉腫 / キメラ遺伝子 / PLC / 遺伝子治療 / アンチセンス / EWS遺伝子 / シグナル伝達 / PKC

Research Abstract

アンチセンスEWS/Fli-1遺伝子cDNAをサイトメガロウイルスのプロモーターを有するpC-DNAベクターに組み込みクローニングした。これをユ-イング肉腫細胞Tc-135Dにトランスフェクションし、ネオマイシン耐性株を10株得ることができた。このうちPCRにて明確なアンチセンスRNAの発現が確認できた3株に対しFli-1抗体で免疫沈降反応を行い、Fli-1蛋白の発現低下が認められた。pC-DNAのみを導入した細胞株に比較し、この3株の細胞増殖速度は遅く、soft agar assayにおいてコロニー形成能が低下し、ヌードマウスの造腫瘍性も低下していた。ユ-イング肉腫ではキメラ遺伝子EWS/Fli-1の発現が腫瘍発生に大きく関与し、その発現を抑制することにより、造腫瘍性が低下することが証明できた。
次いで腫瘍発生におけるEWS/Fli-1のメカニズムを明らかにする目的で、アンチセンス導入細胞と親細胞間で、シグナル伝達に関連する様々な因子、すなわちProteinkinase C(PKC)、Phospholipase(PLC)、Phospholipase D(PLD)を中心に比較した。ウエスタンブロッティングによる検討の結果、アンチセンス導入細胞でPLC-β2、β3、PKC-α、β1、β2が減少していた。PLC-γ1、δ1、β1、RhoA、CDC42には変化が認められなかった。PMA、PDGF刺激によるPLD活性の増加は親細胞の50-60%に減少していた。
以上の結果はEWS/Fli-1の作用を考察する上で意義があり、キメラ遺伝子をターゲットにした遺伝子治療の可能性につながるものと考える。