神経芽腫におけるN-myc増幅度微量定量系の確立と臨床診断への応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07671958
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 井上 玲 東邦大学, 医学部, 講師 (10151599)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡辺 聖 東邦大学, 医学部, 助手 (80167113) ; 神田 尚俊 東京農工大学, 農学部, 教授 (40075429)
• Keywords: 神経芽腫 / N-myc / 遺伝子増幅 / PCR / 競合的PCR / 予後判定

Research Abstract

神経芽腫ではN-myc遺伝子増幅は予後不良と相関していることが明らかにされている。これまで遺伝子増幅の検出にはもっぱらSouthern hybridization法(サザン法)が標準的に用いられてきたが、本法は、結果を得るまでに時間を要すること(1週間程度)、手順が煩雑であること、多量の検体DNAを必要とすること、等の欠点を有している。本研究ではこれらの欠点を克服するべく、PCR法を基本とする簡便・迅速な定量法を確立し、さらにその臨床検体への応用を試みた。
我々は競合的PCR法(cPCR法)を神経芽腫におけるN-myc増幅度定量に応用することにした。最初に制限酵素Mlu1切断箇所を削除したN-mycゲノム断片をもつ競合プラスミドpZH2を作製した。pZH2を用いて計47検体の神経芽腫より得たDNAについてN-myc遺伝子のコピー数を求め、サザン法によって得られたコピー数との比較検討を行ったところ、両者の間の相関係数は0.85であり、cPCR法がサザン法と同等の結果を与えることが示された。本cPCR法によるN-myc遺伝子の定量に要する時間は検体採取日を含めて3〜4日間であり、サザン法に比べかなり短時間でN-myc遺伝子のコピー数を求めることができる。また、検体DNA量についてもわずか200ng程度で実施可能であった。
さらに6例の針生検検体についてcPCR法によるN-myc遺伝子コピー数を調べたところ、針生検検体でもcPCR法によるN-myc遺伝子コピー数算定には十分な検体量であり、結果にもとづいて治療方針を決定することができた。このことから、 cPCR法を用いることによってこれまではN-myc遺伝子コピー数の算定が不可能であったような早期症例でも、N-myc遺伝子コピー数にもとづいた治療方針の決定が可能であることが確認された。

Research Products

• [Publications] Inoue,A,et.al.: "Competitive polymerase chain reaction for the quantification of N-myc gene copy in neuro blastoma." Tumor Biology. 17. 262-270 (1996)
• [Publications] Kong,x-T.,et al: "Genetic alterations of tumor suppressor gene DCC in neuro blastoma" European Journal of Cancer. (予定). (1997)
• [Publications] Inoue,A,et.al.: "Extensive genetic heterogeneity in a nouro blastoma cell line NB (TV) 1." International Journal of Cancer. (予定). (1997)
• [Publications] 井上玲,他: "Competitive PCRによるN-mycの増幅の検索" 小児外科. 29. 11-19 (1997)