破骨細胞のシグナル伝達制御解明(G蛋白質を介するレセプターキナーゼ遺伝子の解析)

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07672021
• Research Institution: 佐賀医科大学
• Principal Investigator: 久木田 明子 佐賀医科大学, 医学部, 助手 (30153266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久木田 敏夫 九州大学, 歯学部, 助教授 (70150464)
• Keywords: 破骨細胞 / クローニング / PCR

Research Abstract

本研究においては、破骨細胞の膜表面に存在するG蛋白質を介したレセプターのレセプターキナーゼのcDNAをクローニングすることを目的とした。そのために、まず、我々が既に作製した破骨細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体Katlに陽性細胞のcDNAライブラリーを用いてクローニングを行うことを試みた。はじめに、このライブラリーが破骨細胞特異的であり、G蛋白質を介したレセプターであるカルシトニンのレセプターを発現しているかどうかを調べた。オーストラリアのDr.Sextonよりラットのカルシトニンレセプター(Cla)のcDNAを頂き、インサートより、polyAを除くプローブを作製し、それを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリー(約1.5X105)をスクリーニングしたところ、6個の陽性クローンが得られた。この6個の陽性クローンについて、カルシトニンレセプターの膜貫通領域に相当するプライマーを作製し、PCR反応と、そのSouthern hybridizationを行ったところ4つのクローンについて陽性のバンドが得られた。また、これらのクローンについて一部の配列を決定したところ、カルシトニンレセプターの配列と一致した。これらの結果から、このKatl陽性細胞のcDNAライブラリーは、カルシトニンのレセプターを高頻度に発現しており、それをリン酸化するレセプターキナーゼも高頻度の発現していることが考えられた。そこで、既に報告されているヒトのレセプターキナーゼの活性部位のよく保存されている領域から二種類のプライマーを作製した。まず、一つのプライマーを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとしPCR反応を行った後、その反応液をテンプレートとしさらにもう一つのプライナーを用いてPCR反応を行った。相当する長さのバンドを切り出しpBluscriptにクローニングし、その塩基配列を解析中である。

Research Products

• [Publications] Jun-Ho Shin: "In vHro differentiation of murine maaophage cell line BDM-1 into osteoclost-like cells." Endocrinology. 136. 4285-4292 (1995)
• [Publications] Li Xin Xu: "Interleukin 10 Selectively inhibits osteocla stoge nesis by inhibiting diffeentiation of osteaclast progenitors into preostesdast-like cells in rat bonemarrou.cultae system." J.Cellula Physiology. 165. 624-629 (1995)
• [Publications] M.Matauzaki: "Intracellula mulriplication of Legionella Preumophila in HL-60 cells furctionally differentiated cin response to 22-oxacalcitriol" J.Leukocyte Biology. 57. 574-580 (1995)