キャピラリー電気泳動とPCRを組み合わせた遺伝子診断法の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07672326
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 荒川 秀俊 昭和大学, 薬学部, 助教授 (70129807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 教授 (00053869)
• Keywords: キャピラリー電気泳動 / 遺伝子診断 / PCR / 日本鎖DNA / 一本鎖DNA高次構造多型

Research Abstract

我々は現在までに以下の点について明らかにした。高分解能キャピラリーゲル電気泳動による一本鎖高次構造多型(SSCP)を検討するため、対象遺伝子としてN-ras及び細菌由来のDive E等を用い、ゲル濃度、分離温度、PCR生成物の塩基数について検討した。その結果、ゲル濃度8%、分離温度25℃、PCR生成物の塩基の長さ59塩基から359塩基で、一塩基変異からなる癌遺伝子のSSCP解析が可能になった。
実際の臨床検体においては、ヒト遺伝子や極微量の試料からDNAを抽出しなければならない。また、SSCP解析では二本鎖DNAから二本以上の一本差DNAの多型が検出されるため、泳動パターンは複雑になる。特に対立遺伝子がヘテロの場合にあh多型同士が重なったSSCPバンドが得られ、検出が不可能になる場合がある。従って、センス又はアンチセンスDNAどちらかを選択的に検出することが必要である。次にSSCPの高感度化と選択性の向上化について検討した。その方法はPCRのプライマーの一方に蛍光剤(テキサスレッド)を標識し、PCRにより増幅と標識を行う。このものを次にHe-Neレザー蛍光検出を備えたキャピラリー電気泳動装置により解析した。その結果K-ras遺伝子の七つの変異を容易に検出することができた。また検出の感度は紫外部吸収(260nm)より1000倍以上高感度であった。さらに本研究では一度に多数の分析を可能にするため、レーザー蛍光検出とマルチキャピラリー(20本のキャピラリーを用いて20検体を同時分析)による方法を開発した。この方法は多検体分析を必要とする臨床診断法として有用である。

Research Products

• [Publications] 荒川秀俊: "Analysis of Single-Strand Conformation Polymorphisms by Capillary Electrophoresis with Laser Induced Fluorescence Detection" J. Pharm.Biomed.Anal.(in press). (1997)
• [Publications] 荒川秀俊: "デキストラン硫酸を分離増強剤とするキャピラリー電気泳動による二本鎖DNAの分離" 分析化学. (in press). (1997)