cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の活性発現に必須な一次構造の解明

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680644
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 那谷 耕司 東北大学, 医学部, 助手 (90202233)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 一郎 東北大学, 医学部, 助手 (50250741)
• Keywords: CD38 / cyclic ADP-ribose / ADP-ribosyl cyclase / cyclic ADP-ribose hydrolase / 細胞内情報伝達物質 / カルシウムイオン / site-directed mutagenesis / クローニング

Research Abstract

研究代表者らが新しく見出した細胞内情報伝達物質cyclic ADP-ribose (cADPR)は、リンパ球の表面抗原であるCD38により合成・分解される。本研究の目的は、cADPR合成・分解酵素(CD38)の活性発現に必須な一次構造を明らかにすることである。平成7年度の研究計画は、計画どおりに進行し、以下の様に期待された成果が得られた。
1.ヒト、ラット、マウスのCD38のアミノ配列および研究代表者らが決定したアメフラシのcADPR合成酵素のアミノ酸配列(Gene158, 213-218, 1995)を比較した結果、アメフラシ酵素に存在する10個のシステイン(Cys)がCD38でも保存されていた。この10個のCys以外にCD38間ではさらに2個のCysが保存されており、アメフラシ酵素ではこれら2個のCysに対応する配列はリジン(Lys)とグルタミン酸(Glu)であることが明らかとなった。
2.研究代表者らはすでにヒトインスリノーマ由来のRNAを鋳型にしたPCR法によりヒトCD38 cDNAを、アメフラシ卵精巣のcDNAライブラリーよりcADPR合成酵素のcDNAを単離しているので、CD38およびアメフラシ酵素のcDNAの1.で同定した領域に、site-directed mutagenesisの手法を用いて変異を導入した。
3.変異を導入したCD38およびアメフラシ酵素のcDNAをpSV2ベクターに組み込んだ後COS-7細胞に導入して、変異を持った酵素をCOS-7細胞に発現させた。
4.ウェスタンブロット法により、変異cDNAを導入したCOS-7細胞中に酵素タンパクが発現していることを確認した。
5.^<32>Pで標識したNADおよびcADPRを基質に、AG-MP1カラムを用いたHPLC法でcADPRの減少とADP-riboseの増大を指標にして、変異cDNAを導入したCOS-7細胞のホモジェネート中の酵素活性を測定した。その結果、CD38でのみ保存されている2個のCysをそれぞれLys, Gluに変異させたCD38はcADPR分解活性を失い、合成活性のみを示した。またアメフラシ酵素のLys, GluをどちらもCysに変異させると、アメフラシ酵素はcADPR合成活性に加えて分解活性も有するようになった。(Diabetes 1994, 244-246, 1995)
6.研究代表者らはヒトCD38遺伝子を単離しその構造及び染色体座位を決定した(Cytogenetics and Cell Genetics, 69, 38-39, 1995)が、その結果ヒトCD38遺伝子からは選択的スプライシングによって上記の2個のCysを欠く変異体が生じることが明らかになった。この変異体のcDNAをCOS-7細胞に発現させたところ、cADPR合成・分解活性は認められなかった。
以上の結果から、CD38の2個のCysがcADPR合成・分解活性に必須であることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Koji Nata: "The structure of the Aplysia kurodai gene encoding ADP-ribosyl cyclase, a second-messenger enzyme." Gene. 158. 213-218 (1995)
• [Publications] Kan-ichi Nakagawara: "Assignment of the CD38, the gene encoding the human leukocyte antigen CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase), to chromosome 4p15." Cytogenetics and Cell Genetics. 69. 38-39 (1995)
• [Publications] Ichiro Kato: "Regulatory role of CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase), in insulin secretion by glucose in pancreatic β cells." Journal of Biological Chemistry. 270. 30045-30050 (1995)
• [Publications] Shin Takasawa: "Requirement of calmodulin-dependent protein kinase II in cyclic ADP-ribose-mediated intracellular Ca^<2+> mobilization." Journal of Biological Chemistry. 270. 30257-30259 (1995)
• [Publications] 東郷 暁: "セカンドメッセンジャーcyclic ADP-ribose合成・分解反応に必須なCD38のCys119とCys201" 糖尿病. 38. 236-236 (1995)
• [Publications] 篁 俊成: "ヒトcyclic ADP-ribose合成・分解酵素(CD38)遺伝子の構造と染色体座位" 糖尿病. 38. 236-236 (1995)
• [Publications] 東郷 暁: "CD38とアメフラシADP-ribosyl cyclaseのアミノ酸置換による酵素活性の変換" 生化学. 67. 540-540 (1995)
• [Publications] 篁 俊成: "CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose)とアメフラシADP-ribosyl cyclaseの遺伝子構造" 生化学. 67. 540-540 (1995)
• [Publications] 高沢 伸: "インスリン分泌におけるcyclic ADP-riboseの役割" 生化学. 67. 538-538 (1995)
• [Publications] 加藤一郎: "CD38トランスジェニックマウスのインスリン分泌" 生化学. 67. 538-538 (1995)
• [Publications] 古谷保人: "ラットcyclic ADP-ribose合成酵素関連遺伝子産物BST-1の構造と発現" 生化学. 67. 697-697 (1995)
• [Publications] 東郷 暁: "ヒトCD38のcyclic ADP-ribose合成・分解酵素活性について" 生化学. 67. 1323-1323 (1995)
• [Publications] 東郷 暁: "ATPは直接CD38に作用してcyclic ADP-ribose分解活性を抑制する" 糖尿病. 39 (in press). (1996)
• [Publications] 高沢 伸: "膵β細胞小胞体からのcyclic ADP-riboseによるCa^<2+>放出のCaM kinase IIによる増強" 糖尿病. 39 (in press). (1996)
• [Publications] 池端史子: "糖尿病患者における抗CD38 (cyclic ADP-ribose合成・分解酵素)自己抗体の存在" 糖尿病. 39 (in press). (1996)
• [Publications] Ichiro Kato: "Enhancement of glucose-induced insulin secretion in transgenic mice overexpressing VIP gene in pancreatic β-cells." Ann. New York Acad. Sci.(in press). (1996)
• [Publications] Atsuya Akabane: "Nicotinamide inhibits IRF-1 mRNA induction and prevents IL1-β-induced nitric oxide synthase expression in pancreatic β cells." Biochem. Biophys. Res. Commum.215. 524-530 (1995)
• [Publications] Hideto Yonekura: "Identification of the five essential histidine residues for peptidylglycine monooxygenase." Biochem. Biophys. Res. Commum.218. 495-499 (1996)
• [Publications] 鈴木 雄: "ヒトVIP遺伝子導入トランスジェニックマウス-VIPによるインスリン分泌と耐糖能改善" Diabetes Frontier. 6. 355-356 (1995)
• [Publications] Shin Takasawa: "Frontiers in Insulin Secretion and Pancreatic B-Cell Research" Peter R. Flatt and Sigurd Lenzen, 123-128 (1995)
• [Publications] Hiroshi Okamoto: "Diabetes 1994" Shigeki Baba and Toshio Kaneko, 244-246 (1995)
• [Publications] 加藤一郎: "ペプチドC末端アミド化酵素:ペプチジルグリシンモノオキシナーゼとリアーゼin“新しい酵素研究法"" 一島英治、小野寺一清(東京化学同人), 85-91 (1995)