1995 Fiscal Year Annual Research Report
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07680645
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
柏木 敬子 千葉大学, 薬学部, 助手 (80169424)
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| Keywords | ポリアミン / スペルミジン / プトレスシン / 輸送 / ATPase / ABC transporter |
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| Research Abstract |
大腸菌のスペルミジン優先取り込み系は基質結合蛋白質(PotD)、ATP結合部位を有する膜表在性蛋白質(PotA)、及び2種のチャンネルを形成する膜貫通蛋白質(PotB及びPotC)より構成されるABCtransporterの一種である。このうちのPotAとPotD蛋白質を均一に精製し、酵素化学的性質を検討すると同時に、site-directed mutagenesisによりアミノ酸置換蛋白質を作製しその性質を検討した。1)精製したPotA蛋白質はATPase活性を示し、その比活性は400nmol/min/mg proteinであり、基質ATPのKm値は385μMであった。ポリアミン輸送欠損株NH1596のPotA蛋白質は135番目のバリンがメチオニンに変異しており、ATPase活性を欠損していた。この系によるポリアミン取り込みがSH阻害剤により阻害されることから、PotA蛋白質中に存在する3個のシステイン残基(C26、C54及びC276)を変異させた結果、54番目のシステイン残基が活性発現に必須であった。従って、PotA蛋白質はN末端側にATPaseの活性中心が存在することが明らかとなった。2)PotD蛋白質のX線結晶解析より、ポリアミン結合に関与するアミノ酸残基が同定されたので、それらを変異させたPotD蛋白質を作製し、ポリアミン結合活性と輸送活性を測定した。その結果、結合活性と輸送活性はほぼ相関しており、4分子の酸性アミノ酸残基(E36、D168、E171、D257)、3分子のトリプトファン残基(W34、W229、W255)、及び3分子のチロシン残基(Y37、Y85、Y293)が基質スペルミジンとの相互作用に関与していた。特にスペルミジンのジアミノプロパン部分と相互作用するE171、W255及びD257の変異により活性が著しく低下することが明らかとなった。
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[Publications] Y.He et al.: "Inhibition of cell growth by combination of α-difluoromethylornithine and an inhibitor of spermine synthase." J. Biochem.117. 824-829 (1995)
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[Publications] K.Igarashi et al.: "Inhibition of the growth of various human and mouse tumor cells by 1,15-bis(ethylamino)-4.8.12-triazapentadecane." Cancer Res.55. 2615-2619 (1995)
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[Publications] J.Fukuchi et al.: "Decrease in cell viability due to the accumulation of spermidine in spermidine acetyltransferase-deficient mutant of Escherichia coli." J. Biol. Chem.270. 18831-18835 (1995)
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[Publications] K.Kashiwagi et al.: "Spermidine-preferential uptake system in Escherichia coli. ATP hydrolysis by PotA protein and its association with membranes." J. Biol. Chem.270. 25377-25382 (1995)
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[Publications] K.Williams et al.: "An acidic amino acid in the N-methyl-D-aspartate receptor that is important for spermine stimulation." Mol. Pharmacol.48. 1087-1098 (1995)
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[Publications] S.Sugiyama et al.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of the primary receptor(PotD)of the polyamine transport system in Escherichia coli." Acta Crystallogr. D. (in press). (1996)
