1995 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
07680663
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Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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Research Institution | Sasaki Institute |
Principal Investigator |
大倉 隆司 (財)佐々木研究所, 生化学部, 研究員 (50183223)
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Keywords | MDCK細胞 / N-結合糖鎖 / GPI-アンカー / ソーティング / VIP36 |
Research Abstract |
ヒトやラット、マウスなどの腎臓糖蛋白質N-結合型糖鎖の構造はγ-GTPややジペプチジルペプチダーゼ-IVなどを用いて、申請者らのグループが既に明らかにしているが、イヌ腎臓由来のMDCK細胞の糖鎖の研究はほとんど行われていない。そこでどの様な糖鎖の特徴があるか、[^3H]-グルコサミンでメタボリックラベルし、それから可溶化した糖蛋白質をヒドラジン分解・N-アセチル化の後、高圧ろ紙電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー、各種レクチンクロマトグラフィー、グリコシダーゼ消化などの方法により分析した。その結果、約1/4が高マンノース型糖鎖、残りが2〜4本鎖複合型糖鎖でアセチルラクトサミン繰り返し構造にフコースや2→6結合したシアル酸の結合した構造であることが明らかになった。現在さらにこれらの糖鎖の局在性について検討中である。 一方VIP36のうち、レクチン様活性が存在すると思われる疎水性部分約800個のアミノ酸に対するcDNAをMDCK細胞よりRT-PCR法でクローニングした(Vip800)。Vip800のcDNAをpQE-9の発現ベクターに導入し、大腸菌で大量発現を試みたが発現量が低く、Vip800を充分量精製することができなかった。そこでpGEX-2TKベクターにおいてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)のcDNA下流につなげ、GSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現したところVip800の大量発現に成功した。GSTは抗原として働かないことが明らかにされているため、現在グルタチオンセファロースカラムを用いて精製した融合タンパク質をVip800の抗原としてVip800に対するポリクローナル抗体を作製中である。
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[Publications] 大倉 隆司: "Increase of fucosylated serum cholinesterase in relation to high risk groups for hepatocellular carcinoma" Cancer Research. 54. 55-61 (1994)
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[Publications] 福島 慶子: "Carbohydrate structures of a normal counterpart of the carcinoembryonic antigen produced by colon epithelial cells of normal adults" Glycobiology. 5. 105-115 (1995)
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[Publications] 山下 克子: "Expression of Siaα2→6Galβ1→4GlcNAc residues on sugar chains of glycoproteins including carcinoembryonic antigens in human colon adenocarcinoma" Cancer Research. 55. 1675-1679 (1995)
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[Publications] 山下 克子: "先天性N-結合型糖鎖転移不全症候群" 臨床検査. 39. 33-38 (1995)
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[Publications] 瀬古 玲: "Quantitative differences in GlcNAc : β1→3 and GlcNAc : β1→4 galactosyltransferase activities between in human colonic adenocarcinomas and normal colonic mucosa" Cancer research. (in press).