分子設計されたNO合成酵素の機能発現及び生体内NOのダイナミクス

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680670
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 清水 透 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (40118956)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐上 郁子 東北大学, 反応化学研究所, 講師 (10143033) ; 小波 秀雄 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (40186713) ; 伊藤 攻 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (30006332)
• Keywords: 一酸化窒素 / 蛋白質工学 / 遺伝子操作 / ダイナミクス / シトクロム / フラッシュ・ホトリシス

Research Abstract

2種類のNO合成酵素、bNOS及びiNOS、のcDNAを米国の研究者より恵与された。これらのcDNAを用いて、2種類のNO合成酵素を昆虫細胞、大腸菌及びパン酵母に発現させることを試みた。昆虫細胞においてはヘムを外部から添加することによりNO合成酵素の発現が効率良くなることが確かめられた。大腸菌については市販の発現ベクターでは成功しなく、より効率の良い発現ベクターを米国より取り寄せている。酵母での発現については、外部より補酵母を添加する必要があることが推定され、添加の効果について現在実験中である。NO合成酵素と相互作用するグアニルシクラーゼのクローニングに成功し、その昆虫細胞、大腸菌、パン酵母における大量発現についても現在検討中である。
NO合成酵素はその活性部位にP450と同じ構造を持つヘム鉄を有している。故にP450はNO合成酵素の良いモデルにもなりうると考え、NOとP450との相互作用を調べた。その結果、P450の遠位に存在するカルボキシル基がNOと直接相互作用していることが各種分光学的方法で確かめられた。このことからNO合成酵素においてもまったく同様な相互作用が存在し、この酵素の活性発現に重要な寄与をしていることが示唆された。

Research Products

• [Publications] 佐藤秀明: "Marked Effects of Alcohols and Imidazoles on the Cumyl Hydroperoxide Reaction with the Wild-Type Cytochrome P450 1A2" Archives of Biochemistry and Biophysics. 322. 277-283 (1995)
• [Publications] 中野亮介: "Marked Detergents Effects on Safranine T-Mediated Photo-Induced Electron Transfer in Cytochrome P-450 1A2" Biochimica et Biophysica Acta. 1252. 245-250 (1995)
• [Publications] 中野亮介: "Tris (2, 2´-bipyridyl) ruthenium (II) -Mediated Photoinduced Electron Transfer of Engineered Cytochrome P450 1A2" Journal of Photobiochemistry and Photobiology. 100(発売予定). (1996)
• [Publications] 中野亮介: "Conserved Glu^<318> at the Cytochrome P450 1A2 Distal Site is Crucial in the Nitric Oxide Complex Stability" Journal of Biological Chemistry. 271(発売予定). (1996)