細胞核骨格構造を構成する蛋白質の機能解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680678
• Research Institution: TOYAMA MEDICAL AND PHARMACEUTICAL UNIVERSITY
• Principal Investigator: 菅野 延彦 富山医科薬科大学, 薬学部, 教授 (40019112)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 日比野 康英 富山医科薬科大学, 遺伝子実験施設, 助手 (10189805)
• Keywords: 高度反復配列DNA / 核マトリックス / リン酸化 / DNA結合蛋白質 / matrin 3

Research Abstract

核マトリックスは、ゲノムDNAを繋ぐ足場としてだけでなく、複製や転写等種々機能と密接に関連した重要な機能的構造体と考えられている。我々は、細胞核の機能構造の一端を解明するために、核骨格構造と強固に結合するDNAと、その結合に直接関与する蛋白質分子(P130)を同定し、それらの諸性質を明らかにしてきた。前年度までの研究によって、P130のDNAに対する結合活性が、分子内のリン酸化によって制御されていることが明らかになった。本年度は、この蛋白質の機能をさらに詳細に解析するため、P130をコードする遺伝子をラットcDNAライブラリーから単離し、そのアミノ酸配列を解析して種々の情報を得た。単離されたcDNAのホモロジー検索により、P130は、すでに報告のあるmatrin3とほぼ同一であることが明らかとなった。mRNAの発現は、調査したすべての臓器で認められ、matrin 3/P130の臓器特異的発現はないと考えられた。一方、モチーフ検索の結果、matrin 3/P130は、アミノ末端側及びカルボキシル末端側の2ケ所にZnフィンガーモチーフを配置し、さらに中央部にRNA結合ドメインを持つ分子であることが明らかになった。DNA結合ドメインの存在を示すこの情報は、すでに精製した蛋白質を用いて得られたmobility shift DNA binding assayの結果より、P130の一分子内に2カ所のDNA結合部位を持つであろうとする結果と一致する。また、推定されるリン酸化部位が分子内に多く存在し、特に、チロシンリン酸化部位が、DNA結合部位と隣接していることが明らかになった。この結果は、DNA結合活性が、蛋白質内のチロシン部位の修飾に依存する結果を強く支持するものであった。そこで、リン酸化状態の変動と機能を結び付けるアプローチの一つとして、細胞周期に伴うこれら蛋白質のリン酸化状態の解析を行った。その結果、分裂増殖期に蛋白質のリン酸化能が高まること、即ち、DNA結合活性を持つP130量が増加することから、この時期での機能分子はP130であると考えられた。さらに、両蛋白質の細胞内での動態を解析するために、より抗体価の高いモノクローナル抗体を単離・調製した。今後は、これら情報を用いて変異蛋白質や融合蛋白質を作成することにより、各機能ドメイン(転写との関連を重視したDNA結合領域やリン酸化部位および蛋白質局在化シグナルなど)の解析が可能と考えられる。これら機能分子の役割をin vitroでの知見を基にして、今後も細胞核の機能を明らかにしてゆくことが必要であると考える。

Research Products

• [Publications] Norihisa Komae: "Morphology and origin of micronuclei induced by mitotic inhibitors" YAKUGAKU ZASSHI. 117. 49-58 (1997)
• [Publications] Yasuhide Hibino: "Purification and characterization of a DNA binding protein in a nuclear scaffold fraction from rat ascites hepatoma cells" Carcinogenesis. 18. 101-107 (1997)
• [Publications] Yasuhide Hibino: "Involvement of phosphorylation in binding of nuclear scaffold proteins from rat liver to a highly repetitive DNA component" Biochimica et Biophysica Acta. 1396. 88-96 (1998)