放線菌S.virginiae信号伝達物質リセプターの機能解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680684
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 仁平 卓也 大阪大学, 工学部, 助教授 (70144441)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井原 史雄 大阪大学, 工学部, 助手 (70252583)
• Keywords: virginiae butanolide / 放線菌 / autoregulator / リセプター / 大量発現

Research Abstract

1.放線菌S.virginiaeよりクローン化したVirginiae Butanolide (VB)リセプタータンパク質遺伝子(barA)について塩基配列を決定し、翻訳開始コドン部分にNcoIサイトを導入した変異型barA遺伝子を構築した。この変異型barA遺伝子よりNcoI-BamHI断片を回収後、大腸菌用発現ベクターpET-3dのNcoI-BamHIサイトに導入した。本ベクターを大腸菌BL21(DE3)/pLysSに形質転換し、IPTG誘導により、組み換え型VBリセプターの大量発現に成功した。更に、培養菌体より、超音波破砕、DEAE-Sephacelイオン交換クロマトグラフィーの2段階の精製操作で、SDS-PAGE上単一バンドを示すVBリセプターを調整する手法を確立した。
2.精製VBリセプターについて、[^3H]VB-C_7をリガンドとするScatchard解析を行い、VBに対してK_d=30nM,B_<max>=1.01を持つことを明らかにした。
3.N-末端側1/10,1/5を除去した変異型VBリセプター、並びにC末端側1/5を除去した変異型VBリセプターを調整した。各々についてVB結合活性を測定したが、いづれもVB結合活性を喪失していた。
4.上記変異型VBリセプターの各々に対して、VB存在下及び不在下でのゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果、いづれも2量体として存在する事が判明した。