表皮細胞の角化に伴うタンパク質脱イミノ化の機能的意義の検証

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680703
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 千秋 達雄 (財)東京都老人総合研究所, 分子老化学研究系・細胞化学部門, 研究室長 (60072998)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大沢 多加子 (財)東京都老人総合研究所, 分子老化学研究系・細胞化学部門, 研究員 (20073017) ; 石神 昭人 (財)東京都老人総合研究所, 分子老化学研究系・細胞化学部門, 研究員 (50270658) ; 浅賀 宏昭 (財)東京都老人総合研究所, 分子老化学研究系・細胞化学部門, 研究員 (80231877) ; 秋山 翹一 (財)東京都老人総合研究所, 分子老化学研究系・細胞化学部門, 研究助手 (10110024)
• Keywords: ペプチジルアルギニンデイミナーゼ / 脱イミノ化タンパク質 / 表皮細胞 / 角化 / ケラチン / フィラグリン

Research Abstract

1.レチノイン酸処理した培養ラット表皮細胞からcDNAライブラリーを作製し、ラット骨格筋タンパク質アルギニン脱イミノ化酵素(PADと略)PAD cDNAをプローブとしてクローニングを行い、少なくとも3種のクローンを得た。内1種は骨格筋PADと相同性を示したが、他の2種は新しいタイプと見られた。5'-RACE法による全長の配列決定と、固体表皮での発現の有無の検討に着手している。
2.マウス新生児表皮角層のケラチンのジスルフィド結合を還元的に開烈して可溶化後、脱イミノ化されたケラチンK1を分別した。これを限定分解して得られたペプチドをゲル電気泳動で分別後、PVDF膜に転写し、脱イミノ化されたペプチドの部分配列を推定したところ、分子内部の桿状ドメインより外側のアルギニン残基が脱イミノ化されていることが示唆された。ペプチドをHPLCで分離して脱イミノ化部位の同定を進めている。
3.出生前後のマウス表皮におけるケラチンとフィラグリンの脱イミノ化動態をデンシトメトリーで解析し、統計的有意性を確認した。また、マウス胎児皮膚の表皮側を気相に曝して器官培養すると、個体皮膚と同様な表皮細胞の分化と脱イミノ化が進むのに反して、全体を培地に浸漬して培養すると細胞の形態や脱イミノ化タンパク質の局在に異常が起こることがわかった。
4.モルモット成獣皮膚にアロンアルファを塗布して剥離した表皮細胞層の脱イミノ化タンパク質を分析した。ケラチンのスポットの一部及びフィラグリンのバリアントとその分解物のほか、高分子領域に検出されるプロフィラグリンも陽性を示した点で、他の動物種と相違した。脱イミノ化蛋白質は角層と顆粒層に局在が見られた。

Research Products

• [Publications] Akihito Ishigami: "All-trans retinoic acid increases peptidylarginine deiminases in a newborn rat keratinocyte cell line." Biochem.Biophys.Res.Commun.223. 299-303 (1996)
• [Publications] Tatsuo Senshu: "Preferential Deimination of keratin K1 and filaggrin during the terminal differentiation of human epidermis." Biochem.Biophys.Res.Commun.225. 712-719 (1996)
• [Publications] Shuhei Kan: "Detection of several families of deiminated proteins derived from filaggrin and keratins in guinea pig skin." Zool.Sci.13. 673-678 (1996)