高分解能核磁気共鳴装置を用いた触媒定数の向上した変異リゾチームの動的挙動の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07680725
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 植田 正 九州大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (90184928)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 敬一 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (10136492) ; 井本 泰治 九州大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (90038282)
• Keywords: 核磁気共鳴法(NMR) / リゾチーム / 大腸菌 / ゆらぎ / 安定同位体ラベル化

Research Abstract

本研究の主目的は、NMRを用いて野生型とArg14とH-is15を切欠したリゾチーム(Δ14, 15リゾチーム)の全アミノ酸残基の主鎖の動きを解析し、酵素活性の増加と共役して分子運動が変動している領域を明らかにすることである。このことを達成するためにまず均一に^<15>Nラベル化した野生型およびΔ1415リゾチームが必要となる。ラベル化する試薬^<15>NH_4Clは、高価であることから、効率の良い発現系を確立する必要がある。タンパク質の均一な^<15>Nラベル化に用いられている最小培地では、我々の研究室で確立している大腸菌の発現系では極端にリゾチームの発現量が低下したため、ベクター及び大腸菌の種類を変えて、最小培地を用いるリゾチームの発現系を検討した。また、同時に、培養条件及び変性リゾチームの精製条件も検討した。その結果、プロモーターpETの下流にリゾチームをコードする遺伝子を接続したベクターを大腸菌BL21 (DE3)に組み込み、リゾチームを発現させる系が最も効率が良いことがわかった。封入体として発現された変性リゾチームは、ソニケーションによる破砕、DNase処理を行なった後、遠心分離した上清を乾固し、8M尿素溶液に溶解し、ゲルクロマトグラフィーにて粗精製した。その後、変性リゾチームを我々が開発した透析法にて再生させ、逆相及びイオン交換樹脂を用いて精製した。この条件で、培地1Lあたり(1gの^<15>NH_4Clを含む)、活性構造を持つリゾチーム5-10mg(野生型)、2-4mg(Δ14, 15リゾチーム)を調製することができた。それぞれのリゾチームにおいて、立体構造が酵母より産生されたそれぞれのリゾチームと同一であることを確認するため、600MHzNMR装置を用いて、それらの^1H-^1HCOSYスペクトルを測定し、フィンガープリント領域(αH-NH相関領域)のスペクトルパターンを比較したところ、個々のプロトンの化学シフトは、概ね同一であることがわかった。

Research Products

• [Publications] Yoshito Abe: "Effect of Salt Concentration on the pKa of Acidic Residues in Lysozyme" The Journal of Biochemistry. 118. 946-952 (1995)
• [Publications] Tadashi Ueda: "Kinetically Trapped Structure in the Renaturation of Reduced Oxindolealanine 62 Lysozyme" Biochemistry. 34. 16178-16185 (1995)