乾燥ストレス応答の転写調節に関与するシス因子DREに結合するタンパク質因子の同定

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07740630
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 野路 征昭 理化学研究所, 植物分子生物学研究室, 奨励研究員 (80271534)
• Keywords: 乾燥ストレス応答 / DRE / 転写因子 / サウスウエスタン法

Research Abstract

シロイヌナズナの乾燥ストレス誘導性遺伝子群の中で、rd(responsive to dehydration)29A遺伝子の転写開始領域に見いだされた乾燥応答に関与する制御領域DRE(Dehydration Responsive Element)に結合するタンパク質因子を同定し、またこのDNA結合タンパク質がrd29A遺伝子の発現にどのように関わっているかという問題を解明、考案するために、DREに結合するタンパク質因子のcDNAクローンの単離を試みた。乾燥処理、低温処理および無処理のシロイヌナズナよりmRNAを調整後、cDNAを合成した。この様にして得たcDNAをそれぞれ大腸菌発現型λファージベクターであるλgt11と結合させることによりcDNAライブラリーを作製した。これを用いてサウスウエスタン法によりDREに結合するタンパク質因子のcDNAの単離を試みた。その結果、DRE配列に結合するタンパク質をコードするcDNAクローンがいくつか得られた。その塩基配列の一部を決定し、ホモロジーサーチを行ったところ、得られたクローンの大部分はRNA結合タンパク質など既知のものであった。ホモロジーサーチの結果、データーベースに登録されている配列との間で有意なホモロジーのない未知の塩基配列を持つcDNAクローンも3個得られた。これら3個のcDNAクローンの長さは2.0kb^〜2.1kbと異なるが同一の遺伝子由来の産物であることが確かめられた。しかしこれらのcDNAの全長の塩基配列を決定したところ、タンパク質をコードする領域が見つからなかった。またプロトプラストを用いたトランジェット発現系を用いて、得られたクローンのDREに対する転写活性化の効果を解析したが、転写の活性化は認められなかった。以上の結果より、原核生物である大腸菌を用いたサウスウエスタン法では、植物などの真核生物における転写因子のクローニングは困難であるのかもしれない。今後は真核生物である酵母を用いたクローニング法も検討していく。