ポリヒドロキシアルカノエ-ト生合成機構の解析と細胞変換による新規生合成系の構築

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07750983
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 福居 俊昭 理化学研究所, 高分子化学研究室, 研究員 (80271542)
• Keywords: ポリヒドロキシアルカノエ-ト / 共重合ポリエステル / 生分解性高分子 / アエロモナス キャビエ / ポリエステル合成酵素 / ポリエステル合成酵素遺伝子

Research Abstract

土壌より単離したAeromonas c aviaeF A440株は中長鎖脂肪酸や油脂を炭素源として3-ヒドロキシブタン酸(3HB)と3-ヒドロキシヘキサン酸(3HH)からなる共重合ポリエステル、P(3HB-co-3HH)を合成・蓄積する。本菌の有するポリエステル合成酵素(PHAシンターゼ)は炭素数4〜6の3-ヒドロキシアシルCoAを基質することが予想されるが、このような基質特異性を示す合成酵素はこれまでに知られていない。本研究では、A. caviae PHAシンターゼ遺伝子(phaC_<AC>)のクローニングと解析を行った。
一次構造既知のPHAシンターゼ間で強く保存されている領域からプライマーを設計し、A. caviae g DNAを鋳型としたPCRによってphaC_<AC>部分断片(920bp)を増幅した。この増幅断片をプローブとしてgDNAライブラリーをスクリーニングし、約20kbp gDNA断片を含むプラスミドpLAAclを単離した。さらにpLAAcl中でプローブと強くハイブリダイズする5.0kbpEcoRV-EcoRI断片について塩基配列を決定した。その結果、1つのプロモーター領域の支配下に5個のオープンリーディングフレーム(ORF)がオペロンを形成し、phaC_<AC>遺伝子はその中の1つであることを明らかにした。本遺伝子がコードするPHAシンターゼは594アミノ酸からなり、その配列はこれまでに知られているPHAシンターゼと25〜40%の相同性を示した。その上流および下流に存在するORFと相同性の高い遺伝子はデーターベース中に見い出されず、これらのORFの機能は不明である。また5.0kbp EcoRV-EcoRI断片はAlcaligenes eutrophus P HB-4株(PHAシンターゼ欠損株)を相補し、ポリエステル合成能を復帰させることを確認した。