アスパラギン結合型糖鎖生合成に関連するヒト新規糖転移酵素遺伝子の単離の試み

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07760097
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 高橋 哲夫 東海大学, 工学部・工業化学科, 講師 (10256167)
• Keywords: アスパラギン結合型糖鎖 / リピド中間体 / 糖転移酵素

Research Abstract

本研究は、ホモロジー・クローニング法と、発現クローニング法の2つのアプローチにより、リピド中間体生合成過程で働く新規のヒト糖転移酵素遺伝子を単離することを目的とした。
ホモロジー・クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、酵母においてリピド中間体生合成過程に働くマンノース転移酵素の遺伝子であるALG2を利用することにした。まず酵母ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより全長約1.9kbのALG2遺伝子をクローニングし、これをプローブとして、2種類のヒト肝臓cDNAライブラリーの検索を行った。2.6×10^5クローンを検索した結果、最終的に6クローンを単離した。そのうちの3クローンについて塩基配列を解析したところ、それぞれUDP-glucronosyltransferase、Gastrin binding protein、Mitochondrial enoyl-CoAHydrataseの遺伝子の一部であることが判明した。現在、残りの3クローンについて塩基配列決定を行っており、終了次第、翻訳領域の検索、遺伝子データベースの検索を行う予定である。
発現クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、X線照射したヒトHeLa細胞とG258変異株を細胞融合し、温度感受性からの回復を指標に第1次形質転換株を3株単離した(XR-2,-6,-8,株)。これらXRクローンについてAlu PCRを行ない、ヒト染色体断片の存在を確認するとともに、[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認した。次にXRクローンにおける目的遺伝子を含むヒト染色体領域をさらに限定するため、XR-6株にX線を照射しG258変異株と融合して第2次形質転換株を5株単離した(WXR-6-2,-7,-9,-10,-12株)。これらWXRクローンについて[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認するとともに、Alu PCRを行なったところ、約1.3kbの増幅ヒトDNA断片が共通に検出された。現在、この共通断片をクローニングし塩基配列を決定している。今後、このヒトDNA断片をマーカーとして、YACライブラリーを検索し目的遺伝子の単離を試みる予定である。

Research Products

• [Publications] 竹下 壱: "マウスFM3A細胞由来G258変異株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒトDNAのクローニング" 日本農芸化学会会誌(臨時増刊). 69. 294- (1995)
• [Publications] 竹下 壱: "Radiation Hybrid法によるマウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒト染色体断片の導入" 生化学. 67. 921- (1995)
• [Publications] 高橋 哲夫: "マウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に関する温度感受性変異に相補的なヒト遺伝子分離" 第8回東工大糖鎖研究会 研究発表要旨. (1995)
• [Publications] 竹下 壱: "Radiation Hybrid法によるマウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒト染色体断片の導入" 第5回ドリコールおよびイソプレノイド研究会講演要旨集. 16- (1995)
• [Publications] 高橋 哲夫: "マウスFM3A細胞由来G258変異株のリピド中間体生合成変異を相補するヒト染色体断片の解析" 日本農芸化学会会誌(臨時増刊). 70. 317- (1996)