ミクロソーム型レチノイン酸合成酵素(シトクロムP-450_<RA>)の酵素化学的特性

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07770085
• Research Institution: Kagawa Medical School
• Principal Investigator: 富田 修平 香川医科大学, 医学部, 助手 (00263898)
• Keywords: シトクロムP-450 / レチノイン酸合成酵素 / モノオキシゲナーゼ / レチノイド / ヘム酵素

Research Abstract

ミクロソームのレチノイン(RA)酸合成活性を司るシトクロムP-450RA(P-450-RA)を精製し、その蛋白化学的性質を明らかにすることにより、分子レベルでのP-450RAの生体内機能(生理的役割)を解明することを本年度の目標をした。まず、RA酸合成活性を指標にP-450RAを精製した。SDS-PAGEによる分子量は、57200であった。CO-還元型のソーレー帯の分光吸収ピークは447nmであった。DLPCを用いた再構成系におけるRA酸合成活性測定の結果より、all-trans,9-cis-RAに対して、それぞれ、38.5、1.6nmol/min/nmolP-450のVmaxと11.6、8.0μMのKmを示した。また本酵素のN末アミノ酸配列(37個)の結果、本酵素はシトクロムP-4501A1(P-4501A1)と同一であることが分かった。そこでP-4501A1活性に特異的な阻害効果を示すα-naphthoflabone(α-NF)と抗P-4501A1抗体、あるいは細胞レベルにおけるRA合成活性阻害剤で知られるcitralを用いて本酵素によるRA合成活性を測定した。α-NFとcitralではKiはそれぞれ25nMと13μMを示し、抗P-4501A1抗体による阻害効果は約70%であった。また本酵素による7-ethoxycoumarinや7-ethoxyresorufinのO-deethylase活性などの薬物代謝活性もP-4501A1によるものと同等の数値を示した。以上のことより、本酵素はP-4501A1と同一であると判断した。
また、生体内でのRA合成における本酵素への基質供給の調節機構のモデルとして、脂質膜および細胞内レチノール結合蛋白質(CRBP)存在下での基質(レチナ-ル)動態を検討した。脂質膜としてDLPCとphosphatidyl ethanolamineを用いて再構成実験を試みた結果、RA合成はCRBPにより負に調節されており、活性はP-4501A1の誘導により増加するという仮説がたてられた。現在この仮説をより示唆するための実験を施行している。

Research Products

• [Publications] Tsubaki,Motonari: "Electron paramagnetic resonance investigation of cytochrome P450_<C21> from bovine adrenocortical microsomes : a new enzymatic activity." Biochim. Biophys. Acta.1259. 89-98 (1995)
• [Publications] Okuyama,Eisaku: "A novel mutation in the cytochrome P-450_<27>(CYP27)gene caused cerebrotendinous xanthomatiosis in a Japanese family." J.Lipid Res.(in press). (1996)