Maillard反応後期生成物の主要構造の決定、及びその生体内発現機構の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07770087
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 令江 熊本大学, 医学部, 助手 (80253722)
• Keywords: メイラード反応 / Advanced glycation end products(AGE) / グリケーション / 蛍光物質 / 糖尿病 / 老化 / ハプテン抗体

Research Abstract

高血糖に伴い多くの生体タンパク質が、非酵素的に糖付加反応を受けている。この反応はメイラード反応と呼ばれ、グルコース等の還元糖がタンパク質のリジン残基を介してシッフ塩基を形成し、アマドリ転位反応生成物に至る前期反応と、更に長期の反応を経て褐色変化、蛍光性あるいは分子間および分子内架橋を特徴とする後期生成物(Advanced Glycation End Protducts;AGE)に至る後期反応から構成される。AGEが糖尿病合併症や老化現象と密接に関係することが指摘されているが、その反応経路や生成物の構造に関する情報は極めて少なく、後期段階の如何なる構造体がこれらの病変発症と関係しているかなどの物質論的な情報に乏しいのが現状である。我々は、AGEの主要構造体の化学構造を決定と、その構造体の生体内発現機構の解明を目的として実験を行い下記のような成果を得た。
1、主要蛍光物質X1の単離および構造解析
最も単純なモデル化合物であるα-Tosyl-L-lysine(Tos-Lys)およびそのmethylester誘導体(Tos-Lys-oMe)やα-Acetyl-Lysine(Ac-lys)さらに単純なγ-Butyric acid(GABA)を用いて、グルコースとメイラード反応させ、蛍光・褐色性のAGE-Tos-Lys、AGE-Tos-Lys-oMe、及びAGE-GABAを調製した。逆相HPLC(C18)による解析の結果、反応時間に比例して顕著に蛍光性を増加させているピーク(主要蛍光物質)を逆相HPLCにより、それぞれのAGE化合物より単離精製した。1H-NMR、13C-NMR(COSY,HMQC,INADEQUATE)およびMass(FABMS,SIMS)スペクトルによる構造解析によって、それぞれの主要蛍光物質(EX330nm,EM450nm)が全く同一のものであることが判明しこれをAGEX1と命名した。AGEX1は2分子のグルコースが2分子のリジンのε-アミノ基を介して結合し、ピリジニウム環を形成している分子量832(AGEX1-Tos-Lysで計算した場合)の蛍光物質(4-keto-5-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-1,7-bis[6-(N-tosyl-L-norleucyl)]-1,7-naphthyridinium)であることが判明した。
2、X1の免疫化学的解析
X1が生体タンパク質に発現しているかどうかを解析するために、X1-Tos-lysをカブトガニヘモシアニン(KLH)と重合させ、兎に免疫することにより抗X1-KLH抗血清を得た。抗X1-KLH抗血清はAGE-Tos-lys,AGE-Ac-lys,AGE-GABAのみならずAGE-BSAやその他のAGEタンパク質と有意に反応したが非修飾化合物やタンパク質とは反応しなかった。更に、生体タンパク質であるヒト正常レンズタンパク質とも反応し、その反応性は加齢に比例して増加した。これらの結果より、AGE-Lys誘導体より分離した主要蛍光物質AGEX1は、AGEタンパク質上に発現するAGE共通の主要構造体の一つであり、生体タンパク質にも発現して加齢により増加していることが判明した。

Research Products

• [Publications] Norie Araki et.al: "Macrophage scavenger receptor mediates endocytic uptake of advanced glycation end products of the Maillard reaction." Eur.J.Biochem.230. 408-415 (1995)
• [Publications] Makino,H.et.al: "Ultrastructure of nonenzymatically glycated mesangial matrix in diabetic nephropathy." Kidney Int.48. 517-526 (1995)
• [Publications] Kume,S.et.al: "Immunohistochemical and ultrastructural detection of advanced glycation end products in atherosclerotic lesions of human aorta using a novel specific monoclonal antibody." Am.J.Pathol.147. 654-667 (1995)
• [Publications] Kimura,T.,et.al: "Are advanced glycation end-products associated with amyloidosis in Alzheimer's disease?" NeuroReport. 6. 866-868 (1995)
• [Publications] Horiuchi,S.et al: "Structures of advanced glycation end products and their role in pathophysiological states in "Dialysis-Related Amyloidosis"" Contib.Nephrol.112. 32-41 (1995)
• [Publications] Suzuki,D et al: "Immunohisotochemical staining of renal biopsy samples in patients with diabetic nephropathy in non-insulin dependent diabetes mellitus using monoclonal antibody to advanced glycation end products." Nephrology. 1. 199-205 (1995)
• [Publications] 東隆行・池田和義・坂本珠美: "細胞工学 別冊 医学実験マニュアルシリーズ" 秀潤社, 17(6,5,6) (1995)
• [Publications] 荒木令江: "糖尿病記録号 日本糖尿病学会編" 医学図書出版, 4 (1995)