ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序解明・DNAポリメラーゼの解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07770199
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 藤本 秀士 九州大学, 医学部, 講師 (30199369)
• Keywords: ヘリコバクターピロリ- / 遺伝子多様性 / DNAポリメラーゼ

Research Abstract

ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序を解明するために、この菌のDNAポリメラーゼの解析を試みた。
H.pyloriDNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングするためのプロープをDegenerated PCRにより作成した。このプロープ作成のためには、Gene bankを検索し、過去に発表されている大腸菌DNAポリメラーゼ遺伝子やTaqDNAポリメラーゼ遺伝子などのアラインメントを行いConserved regionを決定した。その部位の含む最適なPCR primerを選択しdegenerated PCRを行った。その結果、800dpのPCR産物を得た。このPCR産物が目的のものか確認するため塩基配列を決定し、Gene bankのデーターベースを用いてホモロジーを検証したところ、大腸菌のDNAポリメラーゼと非常に高い相同性を示し、このPCR産物がDNAポリメラーゼであることが証明された。
次に、このPCR産物をプロープとしてH.py/orf遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。ライブラリーはUniversity of WashingtonのBerg博士が作成したコスミドライブラリーを用い、コロニーブロットでサザンハイブリダイゼイションを行い陽性のコロニーを探した。約30〜50kbのH.pylorf遺伝子断片をもつクローンを70クローンほど検索した結果、目的遺伝子を含むクローンが見つかった。
このクローンを数種類の制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い同一プロープを用いてサザンハイブリダイゼーションを行って再確認したところ、XbaIフラグメント(約15〜20kb)に目的遺伝子が存在することをつきとめた。現在、このクローンのサブクローニングと塩基配列の決定を行っている途中である。