P.gingivalisのプロテアーゼの欠失株の作成及びその病原性の変化について

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07771768
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 米田 雅裕 九州大学, 歯学部, 助手 (10253460)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / プロテアーゼ / 赤血球凝集活性 / 変異株

Research Abstract

Porphyromonas gingivalisは歯周炎関連細菌のひとつとして注目されている。本菌は強力なプロテアーゼ活性を有し、歯周組織を破壊するだけでなく、好中球の機能を抑制することによって歯周炎の増悪に強く関わっていると考えられている。近年、本菌のプロテアーゼの研究が進み、システインプロテアーゼのひとつであるgingipain-Rについては、遺伝子の塩基配列も明らかになった。我々は、本酵素の生物活性および病原性を追求するために、本酵素活性を欠失したP.gingivalisの変異株を作製することを試みた。まず、P.gingivalisのgingipain-Rをコードする遺伝子の一部を含むshuttle plasmid,pKEVを作製し、大腸菌にトランスフォームさせた。そして本菌とP.gingivalis381株をR-751存在下でmatingさせることによっていくつかのtranconjugantを得た。得られたtransconjugantについて酵素活性測定及びsouthern blotを行い、gingipain-Rの欠失株と確認されたものをG-102株と命名した。G-102株の酵素活性を測定すると、合成基質BAPNA(N-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide)の分解活性は野性株381株の49%に低下していた。ゼラチンフィルムを用いたゼラチナーゼ活性も野性株の約8分の5に低下していた。また、近年P.gingivalisのプロテアーゼと赤血球凝集活性の関係が、注目されているので、G-102株の赤血球凝集活性を野性株のものと比較検討した。その結果ヒツジ赤血球に対する凝集活性が野性株の約4分の1に減少していることが明らかになり、プロテアーゼと赤血球凝集活性をコードする遺伝子は非常に近接した位置に存在すると推察された。今後は本変異株を用いて好中球への影響を調べたり、動物実験を行ったりする予定であり、P.gingivalisのプロテアーゼの病原性がより明らかになると考えられる。