マルチスクリーン顕微鏡の開発と高時間分解での薬理解析への応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07772171
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 小澤 孝一郎 広島大学, 医学部, 講師 (10211822)
• Keywords: マルチスクリーン顕微鏡 / RBL-2H3細胞 / 開口放出 / プロテインキナーゼC / 細胞内情報伝達 / 薬効解析

Research Abstract

マルチスクリーン顕微鏡の開発とその薬理解析への応用を試み、以下の実績を得た。
1.マルチスクリーン顕微鏡-ビデオシステムの開発
蛍光像と明視野像と同時に観察し、細胞動態及び薬理作用を細胞レベルで解析することを目的として、顕微鏡、光学フィルター、超高感度SITカメラ、高画質業務用ビデオデッキ、コンピューター画像解析装置を組み合わせて、マルチスクリーン顕微鏡-ビデオシステムを開発した。
2.RBL-2H3細胞における開口放出の解析
アレルギー反応時に重要な役割を演じる肥満細胞からのヒスタミンの遊離機構を、モデル細胞であるRBL-2H3細胞を本研究において開発したマルチスクリーン顕微鏡-ビデオシステムを用い、解析した。その結果、明視野像においてヒスタミン含有顆粒の開口放出の瞬間を捉えることに成功した。さらに、ヒスタミン含有顆粒内に蛍光性を持つ薬物であるキナクリンを特異的に取り込ませることにより、ヒスタミンの細胞外への放出を、明視野像による開口放出と蛍光像によるキナクリン蛍光の細胞外への放出を同時に捉えることに成功した(Neurochem, Res. 20, 323-, FEBS letters in press)。
3.パルスフローインジェクターの開発
顕微鏡下において、薬物投与時間を秒単位でコントロールできるパルスフローインジェクターを開発した。この装置の使用により、各種薬物の作用時間を0.5秒単位で計測・コントロールすることが可能となった。
上記パルスフローインジェクターを用い、RBL-2H3細胞開口放出に対する各種薬物の影響を検討した結果、開口放出には、複数の情報伝達系が異なる経路で異なる時間軸を持って働いていること発見した(Biochem, Biophys.Res. Commum. in press)。
4.細胞内プロテインキナーゼCの動態解析
プロテインキナーゼCを特異的に蛍光標識する新規蛍光化合物(Fim-1)でRBL-2H3細胞内のプロテインキナーゼCを蛍光標識し、上記(1)のシステムで解析した結果、生きた細胞でのプロテインキナーゼCの細胞内動態の解析に成功し、さらに、開口放出との関連性を明らかにした。

Research Products

• [Publications] Koichiro Ozawa: "Real-time analysis of exocytosis and PKC-translocation in RBL-2H3 cells visualized by video-enhanced light/fluorescence microscopy." Neurochemical Research. 20. 323-324 (1995)
• [Publications] Satoshi Yamamura: "Antiallergic Mimeric Prenylbenzoquinones from Ehretis Microphylia." Phytochemistry. 39. 105-110 (1995)
• [Publications] Koichiro Ozawa: "Different pathways of inhibitory effects of wortmannin on exocytosis are revealed by video-enhanced light microscope." Biochem. Biophys Res. Commun.(in press). (1996)
• [Publications] Koichiro Ozawa: "Quantitative analysis of exocytosis visualized by video-enhanced light/fluorescence microscope reveals two distinct components of exocytosis RBL-2H3 cells." FEBS Letters. (in press). (1996)
• [Publications] Koichiro Ozawa: "Role of calcium, protein kinase C and MAP kinase in the activation of mast cells." Allergology International. (in press). (1996)
• [Publications] 小澤孝一郎: "脳シグナルカスケードと精神疾患(神経伝達物質受容体と関連分子:構造と機能)" 学会出版センター(印刷中), (1996)