1995 Fiscal Year Annual Research Report

DNA複製開始に異常を示すndal及びnda4変異株のサプレッサーの単離と解析

Research Project

Project/Area Number	07780634
Research Institution	Toho University
Principal Investigator	三宅早苗東邦大学, 医学部, 助手 (00256687)
Keywords	サプレッサー / 分裂酵母 / DNA複製 / MCM / nda / ライセンス因子
Research Abstract	DNA複製を1細胞周期につき1回に制御する因子として、ライセンス因子が想定されている。近年、様々な生物種からMCM遺伝子が単離され、そのうちの多くは、DNA複製に関与することが示された。研究代表者は、分裂酵母よりMCMファミリーに属する遺伝子ndal及びnda4を単離し、これらの遺伝子の機能解析を行っている。 ndal及びnda4変異株のサプレッサーの単離を行った結果、nda4変異株のサプレッサーを13株得た。13株のうち、1株がnda4遺伝子そのものに、残りの12株がnda4以外の同一遺伝子座に変異を生じていた。nda4サプレッサー変異株は高温感受性であり、高温で培養すると細胞が伸長するという表現型を示す。サプレッサー遺伝子は生育に必須であり、既知の蛋白質とは相同性のない約70kDの蛋白質をコードしていた。変異株を非許容温度で培養し、フローサイトメトリーを行った結果、1CのDNA含量を持つ細胞が増加することから、サプレッサー遺伝子はDNA複製に関与することが示された。サプレッサー遺伝子産物をGST融合蛋白質として大腸菌内で大量に発現し、精製し、ウサギに免役し、抗体を作製した。この抗体を用いて、nda4産物と結合しているかを免疫沈降法により調べたが、nda4産物とは共沈しなかった。サプレッサー産物とnda4産物は互いに結合していないことが示唆されるが、ある特殊な条件下でのみ結合する可能性は否定できない。サプレッサー遺伝子産物の局在を調べるため、抗体を精製し蛍光抗体法を行ったが、遺伝子産物は検出されなかった。このことから、サプレッサー遺伝子産物は、少量しか発現していない可能性が示唆された。そこで、C末端にFLAGをつけたサプレッサー遺伝子産物を分裂酵母細胞内で大量に発現させ、FLAGに対する抗体を用いて蛍光抗体法を行った。同調していない細胞では、一部の細胞で核に局在が認められた。細胞周期により局在が変化する可能性も考えられるので、現在、詳細な解析を行っている。

Research Products

(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] Kimura K. et al: "Phosphatidylinositol-3 kinase in fission yeast: a possible role in stress responses" Biosci. Biotech. Biochem.59. 678-682 (1995)
[Publications] Tsukui T. et al: "Gene transfer and expression in mouse preimplantation embryos by recombinant adenovirus vector." Mol. Reprod. Dev.42. 291-297 (1995)
[Publications] Makimura M. et al: "Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus." Vaccine. 14. 28-34 (1996)
[Publications] Miyake S. et al: "Efficient generation of recombinant adenovirus using adonovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. 1320-1324 (1996)
[Publications] Miyake S. et al: "Identification of two Xenopus laevis genes, xMCM2 and xCDC46, with sequence homology to MCM genes involved in DNA replication" Gene. (in press).

1995 Fiscal Year Annual Research Report

DNA複製開始に異常を示すndal及びnda4変異株のサプレッサーの単離と解析

Principal Investigator

三宅 早苗 東邦大学, 医学部, 助手 (00256687)

Research Products

[Publications] Kimura K. et al: "Phosphatidylinositol-3 kinase in fission yeast: a possible role in stress responses" Biosci. Biotech. Biochem.59. 678-682 (1995)

[Publications] Tsukui T. et al: "Gene transfer and expression in mouse preimplantation embryos by recombinant adenovirus vector." Mol. Reprod. Dev.42. 291-297 (1995)

[Publications] Makimura M. et al: "Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus." Vaccine. 14. 28-34 (1996)

[Publications] Miyake S. et al: "Efficient generation of recombinant adenovirus using adonovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. 1320-1324 (1996)

[Publications] Miyake S. et al: "Identification of two Xenopus laevis genes, xMCM2 and xCDC46, with sequence homology to MCM genes involved in DNA replication" Gene. (in press).

三宅早苗東邦大学, 医学部, 助手 (00256687)