P-gingivalisスーパーオキシドジスムターゼの部位特異的変異導入

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07807171
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 平岡 行博 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (20097512)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / スーパーオキシドジスムターゼ / SOD / 部位特異的変異 / 金属寛容性

Research Abstract

〈目的〉Porphyromonas gingivalis(P. g. )のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、マンガンと鉄の両者で活性を示す特徴を有する。本研究は、酵素の構造と金属の選択性の関係を検討するためP. g. -SODの活性中心近傍に位置するアミノ酸に変異を導入し、Fe-あるいはMn-SOD型に変化させた酵素を得ることを目的とした。
〈方法〉P. g.ATCC33277から得たSOD遺伝子を含む組換え体pKD210(Nakayama, K. Gene 96 149-150, 1990)からKunkelの方法を用いて部位特異的変異を導入した。得られた変異DNAをpUC18に再度クローニングし、E. coliのSOD欠損株(QC 774)で発現させ、性質を比較した。
〈結果と考察〉1。未変異の組換え体SODは、二量体1モルあたり1.10モルのFeおよび0.38モルのMnを含み、比活性は1600units/mg protein/mol of metalであった。FeおよびMn再構成SODは、金属含有量比活性ともに精製酵素とほぼ同様の値を示し、組換え体酵素が金属寛容性の研究に用い得る、と判断された。
2。72-LeuのコドンCTCをTGGに、77-TyrのコドンTATをTTTに変異させ、夫々72-Trp、77-Pheに置換する組換え分子を得た。両分子とも変異部位以外の塩基配列に変化の無いことを確認し、各々をpUCに18に再クローニングしてQC774で発現させた。
3。酵素活性を比較すると、未変異SOD活性を100とした時、72-Trpおよび77-Phe酵素の活性は各々93、14であった。77-Phe変異(Mn-型への変異)が酵素活性に障害を与えることから、77-TryはSOD活性発現の機構に大きく関与している、と考えられた。今後、変異酵素の化学的性質について検討する予定である。

Research Products

• [Publications] 平岡行博: "Porphyromonas gingivalisスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の部位特異的変異導入" 歯基礎誌(補冊),. 37. 229- (1995)
• [Publications] 平岡行博: "組換えSOD(Porphyromonas gingivalisスーパーオキシドジスムターゼ)のE. coliでの発現" 松本歯学. 21. 344-345 (1995)
• [Publications] Yamakura, F.: "pH-Dependent activity and spectral changes in metal-tolerant Fe/Mn-superoxide dismutase." J. Inorg. Biochem.59. 378- (1995)
• [Publications] 山倉文幸: "大腸菌で発現したPorphyromonas gingivalis SODの諸性質" 生化学. 67. 957- (1995)